摘要：目的 分析甘肅省市售食品中分離的25株單核細胞增生李斯特菌耐藥性和基因組特征，為單核細胞增生李斯特菌引起的食源性疾病的防控提供依據(jù)。方法 以2021—2022年甘肅省市售食品中分離的25株單核細胞增生李斯特菌為研究對象，采用肉湯微量稀釋法檢測菌株對8種抗菌藥物的敏感性，并對菌株進行血清分型和全基因組測序，分析其系統(tǒng)發(fā)育譜系、CC型、ST型、血清型、耐藥表型及基因、毒力基因、抗性基因、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。結(jié)果 25株單核細胞增生李斯特菌分屬譜系Ⅰ、譜系Ⅱ，以譜系Ⅱ為主，共21株（84.0%）。血清型以1/2a為主，共14株（56.0%），分屬10個CC型，其中CC9、CC8和CC121為優(yōu)勢CC型，共占56.0%（14株），發(fā)現(xiàn)一個新的ST型，即ST3142。僅1株單核細胞增生李斯特菌耐藥（4.0%，1/25），為復(fù)方磺胺甲惡唑、紅霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星多重耐藥株，本研究菌株耐藥表型與耐藥基因的攜帶情況基本一致。25株單核細胞增生李斯特菌均攜帶LIPI-1和內(nèi)化素基因，未發(fā)現(xiàn)攜帶LIPI-3的菌株，僅2株ST87型菌株攜帶LIPI-4。16株菌（64.0%）攜帶SSI-1，5株ST121攜帶SSI-2。68.0%（17/25）的菌株inlA基因發(fā)生了提前終止（PMSC）。核心基因組多位點序列分型分析能將不同譜系、血清群和CC型的菌株明顯分開，25株菌共分為10個亞群，與CC型保持一致。結(jié)論 甘肅省市售食品中25株單核細胞增生李斯特菌呈現(xiàn)遺傳進化多樣性，耐藥基因及表型均表現(xiàn)出低耐藥率，且攜帶的毒力基因豐富。

關(guān)鍵詞：單核細胞增生李斯特菌；全基因組測序；耐藥表型；耐藥基因；毒力基因

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Study on antimicrobial resistance and genomic characterization of foodborne Listeria monocytogenes strains in Gansu Province

Zhang Jing1 ， Lan Guang1， Shen Yanqin1， Yan Jing1， Liu Xiaoju1， Xiao Jing2， and Wang Wei2

（1 Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention， Lanzhou 730000;

2 China National Center for Food Safety Risk Assessment， Beijing 100024 ）

Abstract Objective To analyze the drug resistance and genomic characteristics of 25 strains of Listeria monocytogenes isolated from food products sold in Gansu Province and provide a basis for the prevention and control of foodborne diseases caused by L. monocytogenes. "Methods The 25 L. monocytogenes isolated from commercial food in Gansu Province from 2021 to 2022 were collected as research subjects. All 25 strains were performed for antimicrobial susceptibility testing to 8 kinds of antibiotics， serum agglutination and sequenced the whole genome. the lineage， CC type， ST type， serotype， drug resistance phenotype and genes， virulence gene， resistance gene， phylogenetic relationship. Results The 25 L. monocytogenes strains were subtypes as lineage I and lineage Ⅱ， with lineage Ⅱ being the dominated lineage （84.0%， 21/25）. The serotype 1/2a was mainly detected （56.0%， 14/25）. The 25 L. monocytogenes strains were found to belong to 10 CCs， with CC9， CC8 and CC121 the dominant （56.0%， 14/25）， discovered a new ST type， ST3142. Only one of the 25 L. monocytogenes strains was drug resistant （4.0%， 1/25）， multiple drug resistant to trimethoprim/sulfamethoxazole， erythromycin， tetracycline and ciprofloxacin. The drug resistance phenotype was consistent with the carrying status of drug resistance genes. All 25 strains of L. monocytogenes carried LIPI-1 and internalin genes， no strains carrying LIPI-3 were found， and only 2 ST87 strains carried LIPI-4. 16 strains （64.0%， 16/25） carried SSI-1， and 3 ST121 strains carried SSI-2. 68.0% （17/25） of the strains had premature stop codons （PMSC） of the inlA gene. The core genome multilocus sequence typing method could clearly distinguish strains of different lineages， serotypes， and CC types. The 25 L. monocytogenes stains were divided into 10 subgroups， which were consistent with their CC type. Conclusion The predominant L. monocytogenes strains in commercial food in Gansu Province exhibited genetic evolutionary diversity， with low resistance rates in both resistance genes and phenotypes， and carried abundant virulence genes.

Key words Listeria monocytogenes; Whole genome sequencing; Resistance phenotype; Resistance genes; Virulence genes

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的食源性致病菌，中間宿主范圍較廣，高風險食品多為生肉、預(yù)包裝冷藏即食食品、冷凍飲品、調(diào)理肉制品等，人們常因食用了被污染的食品引起李斯特菌病，主要表現(xiàn)為括胃腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)和敗血癥等，易感人群為免疫缺陷者、孕婦、老人和新生兒[1]，病死率高達20%～30%，疾病負擔較高[2]。單核細胞增生李斯特菌的致病力除了與感染劑量、宿主免疫相關(guān)外，還與其攜帶的毒力基因和抗性基因的表達有關(guān)。目前臨床治療李斯特菌病的首選抗生素為青霉素或氨芐西林，備選復(fù)方磺胺甲惡唑[3]，在抗生素選擇壓力下，單核細胞增生李斯特菌耐藥性不斷增強[4-5]，已出現(xiàn)復(fù)方磺胺甲惡唑耐藥株和多重耐藥株[6]。

本研究應(yīng)用全基因組測序技術(shù)（whole genome sequencing，WGS）對單核細胞增生李斯特菌基因組特征進行了分析，包括系統(tǒng)發(fā)育譜系（lineage）、克隆群（clonal complex，CC）、序列型（sequence type，ST）、血清型、耐藥基因、毒力基因、抗性基因、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等遺傳特征，為甘肅省食源性單核細胞增生李斯特菌的監(jiān)測和預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

本研究所用25株單核細胞增生李斯特菌，分離自2021—2022年國家食品污染物和有害因素風險監(jiān)測網(wǎng)采集的甘肅省市售肉與肉制品、乳與乳制品、水果及其制品、食用菌、飲料、冷凍飲品、調(diào)味料、堅果與籽類及其加工制品、餐飲食品、地方特色食品等。所有菌株均經(jīng)生化鑒定復(fù)核確認為單核細胞增生李斯特菌，于含40%甘油的腦心浸液肉湯凍存管中，-80 ℃冰箱保藏?？股厮幬锩舾行詼y試質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213。

1.1.2 實驗儀器和試劑

（1）實驗儀器 " "恒溫培養(yǎng)箱（德國MMM Group公司）；麥氏濁度儀（法國Bio-Meriux診斷產(chǎn)品公司）；NanoDrop 1000微量紫外可見分光光度計（美國Nanodrop公司）；PCR儀（美國伯樂公司），Illumina miniSeqTM測序平臺（美國Illumina公司）。

（2）試劑 " "單核細胞增生李斯特菌藥敏檢測板（上海復(fù)星診斷科技有限公司）；腦心浸液肉湯、血瓊脂平板（北京陸橋技術(shù)有限責任公司）；單核細胞增生李斯特菌血清試劑盒（日本生研株式會社）；全基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）；文庫構(gòu)建及測序試劑盒（美國Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 血清分型

參照日本生研血清試劑的使用說明，對菌株O抗原和H抗原進行血清凝集實驗。

1.2.2 抗生素藥物敏感性試驗

參考國內(nèi)常用抗生素種類、既往國家食源性致病菌耐藥監(jiān)測結(jié)果，根據(jù)CLSI文件推薦選擇藥敏試驗抗生素，采用肉湯微量稀釋法檢測實驗菌株對氨芐西林（AMP）、青霉素（PEN）、紅霉素（ERY）、萬古霉素（VAN）、環(huán)丙沙星（CIP）、四環(huán)素（TET）、美羅培南（MEM）和復(fù)方磺胺甲惡唑（SXT）8種抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。根據(jù)CLSI M45進行耐藥折點的判讀，見表1。

1.2.3 全基因組測序

將待測菌株接種腦心浸液肉湯復(fù)蘇后接種血瓊脂平板，將新鮮培養(yǎng)物制備成菌懸液，使用DNA提取試劑盒提取DNA，NanoDrop 1000微量紫外可見分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，采用Illumina miniSeq平臺進行雙末端測序，使用鳥槍法將基因組DNA隨機打斷，加上接頭進行Paired-End片段（PE-150）建庫，測序深度100×，最后上機測序和下機采集數(shù)據(jù)信息。

1.2.4 全基因組分析

使用FastQC軟件和Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)（Raw data）進行過濾和質(zhì)控。使用SPAdes v3.14軟件進行基因組組裝。使用Prokka v1.14.5軟件進行基因組注釋。使用Roary v3.11.2軟件進行核心基因分析。使用FastTree v2.1軟件采用最大似然法構(gòu)建進化樹，參數(shù)設(shè)定為“-gtr -nt”。采用在線交互式生命樹（Interactive Tree of Life，iTOL）iTOLv4軟件進行作圖展示。

1.2.5 譜系、血清型、克隆群（CC）、序列型（ST）、毒力、抗性和耐藥基因分析

利用巴斯德單核細胞增生李斯特菌數(shù)據(jù)庫分析株菌全基因組序列，得到譜系、血清型、CC型、ST型、毒力及抗性基因。利用Expasy tuanslate tool分析菌株inlA基因是否含有提前終止密碼子，判斷基因組中InlA蛋白是否發(fā)生了提前終止（premature stop codon，PMSC）。

利用ABRicate軟件和ResFinder v4.1數(shù)據(jù)庫，進行基因組序列中耐藥基因分析，參數(shù)設(shè)置中核苷酸最小一致性和最小覆蓋設(shè)定為80%。選取耐藥基因上游和下游各5 kb，上傳至用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫進行BLAST在線比對，篩選其中較為相近的基因序列，下載后進行注釋和比對，并借助于Easyfig軟件展示。使用R語言的pheatmap工具包對耐藥、毒力及抗性相關(guān)基因進行分層聚類，繪制熱圖。

2 結(jié)果

2.1 血清分型結(jié)果

25株單核細胞增生李斯特菌分為3種血清型，其中1/2a血清型14株（56.0%），1/2c血清型7株（28.0%），1/2b血清型4株（16.0%）（圖1）。

2.2 藥物敏感性試驗結(jié)果

對25株單核細胞增生李斯特菌進行了8種抗生素的藥物敏感性試驗，全部菌株對AMP、PEN、VAN、MEM均敏感，敏感率均為100%。25株菌僅1株（LM030）出現(xiàn)耐藥，且該耐藥株（LM030）為多重耐藥株，耐藥譜為TET-ERY-CIP-SXT，菌株總體耐藥率為0.4%（1/25），對TET、ERY、CIP和SXT 4種抗生素的耐藥率也為0.4%（1/25）（表2和圖1）。

2.3 菌株譜系、CC型、ST型

25株單核細胞增生李斯特菌分為2個譜系，其中譜系Ⅱ有21株，占84.0%，譜系Ⅰ有4株，占16.0%（表3）。

25株單核細胞增生李斯特菌共分為10種CC型，其中CC9有7株，占比28%，其次是CC8有4株，CC121有3株。10種CC型共分為11種ST型，除CC155包括ST155和ST705兩種ST型外，其余CC型只包含一種ST型，發(fā)現(xiàn)1個新的ST型，即ST3142，屬于CC7、1/2a血清型、譜系Ⅱ（表3）。

25株單核細胞增生李斯特菌中LM021和LM022均為ST8型，且在不同采樣時間分離自同一家超市自制簡易包裝的壽司樣品，其他相同ST型菌株均來自不同的采樣地點和不同的食品類別。

2.4 基因特征分析

對25株單核細胞增生李斯特菌基于核心基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，相同譜系、血清型和CC型的菌株聚集在一起，分為譜系Ⅰ和譜系Ⅱ2個群，根據(jù)CC型又分為10個亞群（表3和圖1）。

2.5 耐藥基因攜帶情況

25株菌均攜帶介導(dǎo)磷霉素耐藥的fosX基因，其中LM030同時攜帶fosX、ant（6）-Ia、aph（3’）-Ⅲ、dfrG、erm（B）、lnu（B）、lsa（E）、tet（M）和tet（S） 9種耐藥基因，其他菌株除了fosX，未發(fā)現(xiàn)攜帶其他耐藥基因。LM030的耐藥基因與耐藥表型均呈多重耐藥，其中erm（B）介導(dǎo)ERY耐藥，tet（M）和tet（S）介導(dǎo)TET耐藥，dfrG介導(dǎo)SXT耐藥，耐藥表型與耐藥基因型基本一致（圖1），該菌為ST705、1/2a血清型、譜系Ⅱ，來自散裝冷凍生禽肉（雞肉）。

分析其上下游序列，發(fā)現(xiàn)LM030的tet（M）耐藥基因與頭葡萄球菌TW2795（AP014956）和豬鏈球菌LSM102（CP016175）中相應(yīng)序列同源性較高，其另外5個耐藥基因lsa（E）、lnu（B）、ant（6）-Ia、erm（B）和aph（3’）-Ⅲ均位于菌株基因組同一段序列，tet（S）位于基因組不同序列上，此6個耐藥基因同時都與英諾克李斯特菌質(zhì)粒pLI203（CP071158.1）相應(yīng)序列同源，此外，LM030的耐藥基因dfrG與糞腸球菌UAMSEF_08染色體（CP035654.1）相應(yīng)序列同源（圖2～5）。

2.6 毒力基因攜帶情況

25株單核細胞增生李斯特菌均攜帶李斯特菌毒力島（Listeria pathogenicity island，LIPI）LIPI-1，在LIPI-1的6個毒力基因prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB中，2株CC155不攜帶prfA基因，1株CC8和1株CC87不攜帶actA。25株單核細胞增生李斯特菌共攜帶了13種內(nèi)化素基因（Internalin genes）inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlE、inlF、inlG、inlH、inlJ、inlK、inlL和inlP4，其中所有菌株均攜帶inlA、inlB、inlC和inlK，1株ST155菌株不攜帶inlC2和inlH基因，7株ST9菌株均不攜帶inlD基因，1株ST8株菌不攜帶inlE基因，1株ST8、1株ST14和3株ST121株菌不攜帶inlF基因，1株ST14、3株ST121、1株ST101、2株ST1032、2株ST87株菌均不攜帶inlG和inlL基因，同時4株ST8的菌株也均不攜帶inlL，1株ST8、1株ST121和2株ST1032株菌不攜帶inlJ基因，僅2株ST378株菌攜帶inlP4，25株單核細胞增生李斯特菌中17株菌的inlA基因發(fā)生了提前終止（PMSC）。全部菌株均不攜帶LIPI-3。僅2株ST87攜帶LIPI-4（圖1）。

2.7 抗性基因攜帶情況

25株單核細胞增生李斯特菌有16株（64.0%）攜帶應(yīng)激生存島（stress survival islet，SSI）SSI-1，其中4株譜系Ⅰ菌株有2株（均為CC5）攜帶SSI-1，攜帶率為50.0%（2/4），21株譜系Ⅱ菌株有14株（分別為1株CC7、4株CC8、7株CC9和2株CC155）攜帶SSI-1，攜帶66.7%（14/21），僅有3株譜系Ⅱ中的ST121攜帶SSI-2，攜帶率為14.3%（3/21）（表4和圖1）。未發(fā)現(xiàn)李斯特菌基因組島（listeria genomic island，LGI）LGI1（抗季銨鹽類消毒劑基因bcrABC、emrE、emrC、qacA和qacH）、LGI2（抗重金屬鎘基因cadA和cadC以及抗重金屬砷基因arsD1、arsA1、arsR1、arsD2、arsR2、arsA2、arsB1和arsB2組成）及相關(guān)轉(zhuǎn)座子。

3 討論

單核細胞增生李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于多種食物[7-9]，大多數(shù)單核細胞增生李斯特菌株屬于譜系Ⅰ（包括4b、1/2b、3b、4d、4e和7血清型菌株）和譜系Ⅱ（包括1/2a、1/2c、3a、3c和4h血清型菌株），僅少數(shù)菌株屬于譜系Ⅲ和譜系Ⅳ（包括4a、4c和4b血清型菌株）[10-11]，目前ST型多達3，142種，本研究菌株分屬譜系Ⅱ（1/2a、1/2c）和譜系Ⅰ（1/2b），優(yōu)勢CC型為CC9、CC8和CC121，優(yōu)勢ST型為ST9、ST8和ST121，未發(fā)現(xiàn)譜系Ⅲ和譜系Ⅳ菌株，此外，值得注意的是，本研究還分離到2株ST87菌株，ST87被認為是我國臨床李斯特菌病的主要克隆[7]。本研究譜系、血清型、CC型、ST型分布與我國食品中單核細胞增生李斯特菌的基因組總體特征報道的特點相一致[12]。結(jié)合樣品信息經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)一起持續(xù)污染的同源性食品安全事件，已按相關(guān)程序處理，其他菌株的聚類均來自不同采樣地點的不同食品類別，這可能與污染的食品在不同區(qū)域流通有關(guān)。

基于全基因組測序分析致病菌耐藥基因已被廣泛應(yīng)用，這對于發(fā)展耐藥菌預(yù)防和控制策略，以應(yīng)對世界范圍的抗生素耐藥性至關(guān)重要[13]。通過藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，25株單核細胞增生李斯特菌中僅1株耐藥，總體耐藥率低，與國內(nèi)報道的單核細胞增生李斯特菌低耐藥率結(jié)果一致[14]，與沙門菌、致瀉大腸埃希菌等常見食源性致病菌相比其耐藥率、多重耐藥率明顯偏低[15-16]。25株菌株均攜帶介導(dǎo)磷霉素耐藥的fosX基因，這可能與李斯特菌對磷霉素具有天然耐藥性有關(guān)[17]。有研究表明，細菌耐藥性與抗生素的大量廣泛應(yīng)用有關(guān)，本研究中的這株耐藥菌攜帶四環(huán)素耐藥基因tet（M）和tet（S），紅霉素耐藥基因erm（B），四環(huán)素，紅霉素作為廣譜抗生素，對革蘭陽性菌有較強的抑制作用，但由于在養(yǎng)殖業(yè)中及臨床上大量廣泛使用，使得細菌為了應(yīng)對抗生素選擇壓力而產(chǎn)生耐藥性且耐藥水平不斷提高[6]。近年來食品及臨床分離的單核細胞增生李斯特菌耐藥譜逐漸變寬，氨芐西林、青霉素作為治療李斯特菌病的臨床一線藥物，目前法國、丹麥、葡萄牙和巴西等國均出現(xiàn)耐受甚至多重耐藥株的報道[18-23]，本研究中發(fā)現(xiàn)的一株單核細胞增生李斯特菌攜帶甲氧芐氨嘧啶耐藥基因dfrG，該基因?qū)е屡R床治療李斯特菌病的備選抗生素復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥。對耐藥基因上下游序列進行分析發(fā)現(xiàn)其耐藥基因tet（M）與頭葡萄球菌、豬鏈球菌具有同源性，提示該耐藥株的tet（M）的耐藥基因可能來源于這些菌，該耐藥機制有待進一步研究。單核細胞增生李斯特菌LM030的6個耐藥基因與英諾克李斯特菌質(zhì)粒pLI203（CP071158.1）同源，推斷該耐藥基因可能是通過質(zhì)粒獲得的，質(zhì)粒作為可移動元件的一種，其介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移是李斯特菌重要耐藥機制之一，此外還有攜帶有抗生素耐藥基因的轉(zhuǎn)座子、整合子等，已有研究發(fā)現(xiàn)這些可移動元件在腸球菌和鏈球菌中非常常見，同時可以在腸球菌、鏈球菌和李斯特菌之間相互傳遞[24]。提示在李斯特菌病的臨床救治中可以正常使用常規(guī)抗生素但同時也應(yīng)謹慎、合理使用抗生素，減緩細菌耐藥性的產(chǎn)生，同時探明李斯特菌的耐藥機制對于李斯特菌病的預(yù)防和控制同樣具有重要意義。

單核細胞增生李斯特菌的致病性與其毒力基因之間存在緊密關(guān)聯(lián)，缺失毒力基因使其致病性明顯減弱甚至完全喪失。本研究中全部單核細胞增生李斯特菌均攜帶LIPI-1、內(nèi)化素基因，有研究表明LIPI-1與單核細胞增生李斯特菌的致病性密切相關(guān)，是細菌在細胞內(nèi)生存必不可少的，具有高度的保守性[25]。本研究中除了2株CC155 prfA基因，1株CC8和1株CC87的actA基因有缺失外，其余基因均未缺失，具有較高的穩(wěn)定性。內(nèi)化素基因與單核細胞增生李斯特菌的黏附、侵襲有關(guān)，其中inlA、inlB、inlC、inlK的檢出率達100.0%，其他inl基因在特定型別中有缺失，這與已有的研究結(jié)果一致[26-27]，在一些分離株inlA基因中有過早終止密碼子（PMSC），導(dǎo)致編碼的InlA蛋白功能下降或失活[28]。本研究未發(fā)現(xiàn)攜帶LIPI-3的菌株，LIPI-3由8個基因組成，編碼第二溶血素，又名李斯特菌素S（lls）[29]，常從譜系I的部分單核細胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌檢出[30]。LIPI-4是新發(fā)現(xiàn)的一個毒力島，共含有6個基因，與單核細胞增生李斯特菌的神經(jīng)感染和母胎感染密切相關(guān)，能增強侵襲感染能力[31]，本研究中2株ST87單核細胞增生李斯特菌均攜帶LIPI-4，這與當前本領(lǐng)域內(nèi)諸多研究結(jié)論基本一致[32]，ST87同時攜帶了LIPI-1、內(nèi)化素基因、LIPI-4這也可以解釋ST87為臨床高毒株的原因。

應(yīng)激生存島SSI-1與單核細胞增生李斯特菌對高濃度氯化鈉、高濃度膽鹽和低pH值等環(huán)境因素的耐受性有關(guān)[33]，本研究中大多數(shù)型別都攜帶SSI-1；應(yīng)激生存島SSI-2可使菌株在堿性條件和氧化脅迫下繼續(xù)存活，能夠在食品加工條件下長期存在[34]，本研究中僅ST121攜帶，目前單核細胞增生李斯特菌除了ST121，在其他型別中未發(fā)現(xiàn)攜帶SSI-2基因島的報道[35]。

綜上，甘肅省市售食品中單核細胞增生李斯特菌以譜系Ⅱ、1/2a血清型菌株為主，CC9、CC8和CC121為優(yōu)勢CC型，且有2株流行性高毒菌株ST87，總體耐藥率低，但有四環(huán)素、紅霉素及復(fù)方磺胺甲惡唑多重耐藥株的出現(xiàn)，耐藥基因和毒力基因分布廣泛，提示在養(yǎng)殖業(yè)及臨床上，應(yīng)謹慎使用抗菌藥物，同時應(yīng)重視單核細胞增生李斯特菌耐藥基因及毒力基因監(jiān)測，并在食品安全風險監(jiān)測中加強檢測和監(jiān)管力度。

參 考 文 獻

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