支大龍　季維智　牛昱宇

從現(xiàn)代遺傳學(xué)之父——孟德爾發(fā)現(xiàn)遺傳規(guī)律開始，到劍橋大學(xué)兩位年輕科學(xué)家——沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA是由兩條核苷酸鏈組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，再到現(xiàn)如今在人類胚胎上實(shí)現(xiàn)基因組的定向修飾，科學(xué)家從未停止對(duì)生物遺傳信息的研究。那么科學(xué)家是用什么工具研究基因的功能，甚至去編輯基因信息呢？對(duì)基因組的編輯好比對(duì)文本進(jìn)行修改一樣，首先找到“文本”的錯(cuò)誤或者想要修改的地方，然后刪去錯(cuò)誤的地方或加入“文字”?；蚪M編輯過程中，如何找到目的基因，并對(duì)它進(jìn)行編輯呢？

什么是基因組編輯

基因是決定生物性狀的基本遺傳單位?；蛲ㄟ^復(fù)制穩(wěn)定地保持生物的基本特征，但是這個(gè)過程有時(shí)會(huì)受到外界環(huán)境的干擾。比如，在受精卵的發(fā)育過程中。外界環(huán)境的影響可能使子代的基因組發(fā)生變化，這種影響可能導(dǎo)致基因堿基的缺失、插入甚至突變。造成機(jī)體發(fā)生病變，這類疾病通常會(huì)遺傳給下一代，也就是通常所說的遺傳性疾病。對(duì)這類疾病發(fā)病機(jī)理的研究需要構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型，通過對(duì)基因組修飾的方法加以研究，這種技術(shù)稱為基因組編輯技術(shù)。具體修飾方式與遺傳性疾病的形成方式相類似：基因的定點(diǎn)突變、小片段的刪失，以及目的基因的插入等。該技術(shù)被形象地譽(yù)為“DNA巡航導(dǎo)彈”，曾榮獲《自然》周刊年度最受關(guān)注的技術(shù)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)不僅可以深入了解疾病發(fā)病機(jī)理，構(gòu)建具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動(dòng)物和探索新型疾病治療方案，還可以更準(zhǔn)確地探究基因功能，是后基因組時(shí)代研究基因功能的重要手段。

傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)是利用胚胎于細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）與同源重組技術(shù)（即非姐妹染色單體間發(fā)生遺傳信息的重組），對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾，這是最常見的一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。該技術(shù)首先需要獲得ES細(xì)胞系，然后利用同源重組技術(shù)獲得經(jīng)過基因編輯的ES細(xì)胞，通過顯微注射方式將經(jīng)過修飾的ES細(xì)胞注射至受體胚胎內(nèi)。這種經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞仍具有分化成機(jī)體所有類型細(xì)胞的能力，可以與受體胚胎進(jìn)行整合，使得被修飾過的遺傳信息傳遞給受體，并最終實(shí)現(xiàn)生殖系遺傳。

然而，這種基于ES細(xì)胞的同源重組基因打靶技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)基因組的定點(diǎn)突變，但是依賴于胚胎干細(xì)胞的獲得、胚胎干細(xì)胞嵌合到動(dòng)物生殖細(xì)胞的能力，以及同源重組在胚胎干細(xì)胞中的重組效率等因素，導(dǎo)致這種基因打靶技術(shù)周期長、效率低、耗時(shí)長，并有明顯物種限制等缺陷。與上述基因打靶技術(shù)相比，基于人工核酸酶的基因組編輯技術(shù)，憑借其效率高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，迅速成為生物醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)。

人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯

核酸酶可以水解DNA的特異堿基序列，通過人為改造，可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的修飾。目前主要的人工核酸酶有三種：鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（transcription activator-like effectornucleases。TALEN）和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。這三類人工核酸酶的結(jié)構(gòu)組成大致可以分成兩部分：DNA識(shí)別區(qū)域和DNA切割區(qū)域，但是每一種人工核酸酶的識(shí)別和切割方式不同，ZFN和TALEN是通過氨基酸與堿基的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行識(shí)別，而CRISPR系統(tǒng)則通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成這一過程。

這三種基因組編輯技術(shù)的工作原理大致相似：DNA的特異性結(jié)合，限制性內(nèi)切酶在特定DNA位點(diǎn)進(jìn)行切割，DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生修復(fù)機(jī)制。修復(fù)機(jī)制有兩種：非同源末端連接和同源重組修復(fù)機(jī)制。對(duì)損傷DNA進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾。

鋅指核酸酶

鋅指核酸酶是第一代人工核酸酶，由鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的識(shí)別，核酸酶Fok I對(duì)DNA進(jìn)行精確切割。其中ZFP負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合三個(gè)連續(xù)的堿基，而核酸酶Fok I則需要與兩個(gè)鋅指蛋白形成二聚體才具有酶切活性。將DNA雙鏈切開，誘發(fā)細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，鋅指核酸酶技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠等多種模式動(dòng)物的遺傳研究，成功實(shí)現(xiàn)了基因的修飾，在2005年，鋅指核酸酶技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類細(xì)胞的基因的定點(diǎn)修飾。

ZFN技術(shù)是最先應(yīng)用的人工核酸酶技術(shù)，它與ES細(xì)胞同源重組基因打靶技術(shù)相比有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：基因組定點(diǎn)修飾不需要獲取ES細(xì)胞就能實(shí)現(xiàn)，敲除效率明顯提高，無明顯的物種限制。然而在利用ZFN對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行基因修飾的實(shí)際的操作過程中，每一個(gè)特定靶點(diǎn)都需要構(gòu)建龐大的鋅指表達(dá)文庫才能更精確地識(shí)別目的基因，這一過程需要在體外或細(xì)菌、酵母等體系中檢測ZFN的切割活性，并從中篩選出具特異性且高效表達(dá)的鋅指蛋白，這一構(gòu)建過程需要投人大量時(shí)間和精力，且費(fèi)用較高。

類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶

類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶是第二代人工核酸酶。TALEN的結(jié)構(gòu)與ZFN類似，其中TALE蛋白完成對(duì)DNA的識(shí)別，而核酸酶Fok I仍然是對(duì)DNA進(jìn)行切割。與在ZFN中一樣。核酸酶Fok I需要與兩個(gè)TALE蛋白結(jié)合形成二聚體，才能完成對(duì)靶位點(diǎn)的精確切割，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的基因修飾。目前TALEN技術(shù)已成功應(yīng)用于包括果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠以及人多能干細(xì)胞等的基因組修飾。2014年。中國科學(xué)家利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)非人靈長類X染色體連鎖基因MECP2基因的敲除。

TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)相比實(shí)現(xiàn)了巨大的突破。第一，TALEN在構(gòu)建上比ZFN更容易和高效，且TALEN的篩選只需要簡單的分子克隆技術(shù)就可以完成；第二，TALEN有更加廣泛的靶位點(diǎn)選擇范圍，且在DNA序列的特異識(shí)別上能力更強(qiáng)，效率也高。但TALEN的缺陷是：TALEN與ZFN一樣，識(shí)別靶向基因的成分是蛋白質(zhì)，當(dāng)需要構(gòu)建識(shí)別20bDDNA的TALEN蛋白時(shí)，可能需要設(shè)計(jì)含有一千多個(gè)氨基酸的TALEN蛋白，該過程耗時(shí)耗力，還可能引起未知的機(jī)體免疫反應(yīng)，降低TALEN在細(xì)胞中的作用；另外，目前TALEN還不能很好地解決高效識(shí)別目的基因的問題，而這正是基因敲除中的重要環(huán)節(jié)。

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)是第三代人工核酸酶，該系統(tǒng)最初在原核生物中被發(fā)現(xiàn)，它使生物具有某種獲得性免疫功能，從而具備抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外來DNA入侵的免疫能力。直到2013年，該系統(tǒng)才被改造成為一種新型的基因組編輯技術(shù)，該系統(tǒng)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢迅速成為全球生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新寵。

CRISPR系統(tǒng)一般由兩部分構(gòu)成：CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄的RNA以及CRISPR-associated（Cas）蛋白，其中II型CRISPR系統(tǒng)即CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組編輯。與ZFN和TALEN不同，在CRISPR系統(tǒng)中CRISPR基因座負(fù)責(zé)特異性識(shí)別DNA，而Cas9核酸酶則具有與ZFP和TALE蛋白相似的功能，即切割DNA片段，使DNA發(fā)生雙鏈斷裂進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷修復(fù)。目前，CRISPR/Cas9已經(jīng)在斑馬魚、大鼠、小鼠、猴以及人類細(xì)胞等成功實(shí)現(xiàn)基因的靶向修飾。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比于ZFN和TALEN有著明顯的優(yōu)勢：由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行基因的定位，因此與ZFN和TALEN相比，它在基因組中搜索的范圍更廣；CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)基因識(shí)別序列，可以完成ZFN和TALEN不能實(shí)施的對(duì)多個(gè)基因同時(shí)定點(diǎn)修飾的功能：CRISPR/Cas9系統(tǒng)在構(gòu)建方面比ZFN和TALEN更簡易且成本較低；CRISPR/Cas9系統(tǒng)易于改造，以實(shí)現(xiàn)更多生物學(xué)功能。然而，與ZFN、TALEN這些人工核酸酶一樣，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也存在不能高效識(shí)別目的基因的問題。

基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用

基因功能研究

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)家迫切希望對(duì)基因功能進(jìn)行更加深入的研究，其中將目的基因敲除是基因功能研究中不可缺少的環(huán)節(jié)。隨著ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展，許多物種實(shí)現(xiàn)了單個(gè)或者多個(gè)靶基因的敲除，極大地推動(dòng)了基因功能的研究。例如，利用ZFN技術(shù)在大鼠上成功實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除，并證實(shí)該基因突變可穩(wěn)定遺傳至下一代；運(yùn)用TALEN技術(shù)對(duì)斑馬魚的Tnikb和Dip2a兩基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，隨后證明這種突變可穩(wěn)定遺傳：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)編輯5個(gè)不同基因，使得深入研究基因家族成員的功能相關(guān)性成為可能。

基因治療

基因治療是將表達(dá)異常的致病基因利用基因編輯技術(shù)，將其改造為正?；?，實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。傳統(tǒng)基因治療方法不僅很難將細(xì)胞中的缺陷基因的精準(zhǔn)替換為正?；颍铱赡軙?huì)將外源遺傳信息遺留在細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可預(yù)知的作用。而人工核酸酶技術(shù)則可以在靶位點(diǎn)對(duì)基因?qū)嵤┚_的編輯或敲除，實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。

ZFN和TALEN作為最先發(fā)展的人工核酸酶技術(shù)，在基因治療方面有著廣泛的應(yīng)用。利用ZFN技術(shù)在敲除小鼠突變的血友病基因后，再利用病毒載體將正常基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)血友病的治療。此外，利用傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體遺傳信息的改造。而將TALEN技術(shù)成功應(yīng)用于線粒體突變基因的敲除，則使得治療由線粒體DNA突變引起的疾病成為可能。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第三代人工核酸酶技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于疾病的基因治療。胡文輝等運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)首次將艾滋病病毒從人細(xì)胞中清除，這對(duì)于艾滋病的治愈有著重要意義；尹浩等利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾了可導(dǎo)致酪氨酸血癥I型的基因，成功糾正了部分存在于肝細(xì)胞中的突變基因，將正常肝細(xì)胞恢復(fù)至總量的三分之一，這足以治愈該病，

人類疾病模型

在人類疾病發(fā)病機(jī)制和藥物篩選研究中，構(gòu)建人類疾病動(dòng)物模型有著不可替代的重要作用。靈長類動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于其在生理生化和遺傳上與人類高度接近，成為研究人類疾病適宜的動(dòng)物模型。

2014年，筆者所在研究組與合作者利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)食蟹猴x染色體連鎖基因MECP2基因的敲除，首次成功構(gòu)建非人靈長類動(dòng)物模型。MECP2基因位于x染色體，該基因的突變通常會(huì)造成雄性胎兒在妊娠中期發(fā)生死亡，而雌性胎兒則可順利出生并存活，該胎兒在出生后6-18個(gè)月發(fā)生病變，表現(xiàn)出自閉癥特點(diǎn)的“Rett綜合征（Rett syndrome）”，這是一種嚴(yán)重影響女性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的疾病。

同年，筆者與合作者又利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)食蟹猴基因組進(jìn)行修飾，獲得多位點(diǎn)基因敲除的雙胞胎食蟹猴，這是CRISPR/Cas9技術(shù)首次應(yīng)用于非人靈長類，對(duì)于一些由多基因控制的神經(jīng)退行性疾病的研究（例如帕金森?。┖拖嚓P(guān)疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建有著非常重要的意義。通過進(jìn)一步檢測新生小猴臍帶和胎盤的DNA樣本，沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。此外，對(duì)流產(chǎn)胎兒的生殖系細(xì)胞利用單細(xì)胞測序技術(shù)進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞也發(fā)生了基因突變，首次證明運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因突變可以實(shí)現(xiàn)生殖系遺傳。

挑戰(zhàn)與展望

傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)在人類疾病動(dòng)物模型建立和發(fā)展新的基因治療手段中，發(fā)揮著重要的作用，而人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)憑借獨(dú)特優(yōu)勢，更是極大地推動(dòng)了生命科學(xué)研究的進(jìn)程，其中利用CRISPR/Cas9構(gòu)建的靈長類動(dòng)物模型對(duì)于研究人類疾病具有里程碑式的意義。但即使是TALEN，CRISPR/Cas9這些能精確進(jìn)行基因修飾的人工核酸酶技術(shù)也處于發(fā)展的初級(jí)階段，很多問題有待解決，如怎樣提高打靶效率獲得純合的基因編輯子代，外源基因的定點(diǎn)敲入等。此外。體細(xì)胞核移植技術(shù)是獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最為可靠和有效的方法，在未來的研究中將人工核酸酶技術(shù)與核移植技術(shù)結(jié)合，可以更高效地建立人類疾病的動(dòng)物模型，為深入研究疾病發(fā)病機(jī)制和探索新的治療方案提供更多可能。