伍潔牡丹江市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江牡丹江157013

結(jié)直腸腺癌BRAF基因突變對(duì)臨床治療和預(yù)后的意義

伍潔
牡丹江市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江牡丹江157013

[摘要]目的研究結(jié)直腸腺癌BRAF基因突變對(duì)臨床治療和預(yù)后的意義。方法整群收集該院2009年1—12月經(jīng)病理科診斷手術(shù)的166例癌組織標(biāo)本及61例癌旁正常組織。用PCR-DNA測(cè)序法測(cè)BRAF突變情況,對(duì)病理資料統(tǒng)計(jì)和隨訪60個(gè)月生存情況。結(jié)果①癌組織中BRAF突變率9.04%，常見(jiàn)類型BRAF-V600E，癌旁正常組織無(wú)突變。②癌組織分級(jí)低突變率較組織分級(jí)高的患者高，有淋巴轉(zhuǎn)移突變率較無(wú)轉(zhuǎn)移患者的高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、發(fā)病部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。③癌組織為BRAF突變型的患者生存率較野生型的低，兩條生存曲線明顯分開(kāi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論結(jié)直腸癌患者中，癌組織BRAF基因突變率明顯高于癌旁正常組織與分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，與患者生存率成負(fù)相關(guān)提示預(yù)后不良。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸癌；BRAF基因；生存率

我國(guó)CRC發(fā)病率以每年3.9%速度遞增占惡性腫瘤的第3位，病死率第5位[1]?；颊叽_診后5年存活率僅為55%左右。隨著對(duì)CRC發(fā)病分子機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路的深入研究，證明RASBRAF-MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活與惡性腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展和惡性程度密切相關(guān)[2]。原癌基因BRAF作為一種基因編碼的絲/蘇氨酸特異性激酶，是該通路重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,使凋亡誘導(dǎo)因子失活減少細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、組織分化、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等。隨著靶向藥物臨床應(yīng)用，有效降低了患者死亡率提高生存質(zhì)量，同時(shí)出現(xiàn)了臨床耐藥[3]。臨床證實(shí)KRAS、BRAF基因突變患者在抗EGFR靶向治療中無(wú)效，預(yù)后生存差，只有野生型患者才能從抗EGFR單克隆抗體治療中獲益[4]。BRAF基因與臨床耐藥及不良預(yù)后的關(guān)系尚有爭(zhēng)議[5]，該研究旨在探討其對(duì)臨床治療和預(yù)后的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集該院2009年1—12月經(jīng)病理科診斷手術(shù)166例原發(fā)結(jié)直腸癌腺癌組織標(biāo)本及其癌旁正常組織61例作為對(duì)照組。年齡19～76歲，平均年齡(49.9±10.1)歲?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。統(tǒng)計(jì)病理資料和隨訪60個(gè)月生存情況，有5人失訪。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織DNA分子提取采用德國(guó)Qiagen公司的DNA提取試劑盒。對(duì)組織蠟塊切8 μm厚10張水展后用膜片撈出，切取4 μm厚1張HE染色鏡下觀察腫瘤集中區(qū)域。用激光共聚焦切割儀選取切片上對(duì)應(yīng)腫瘤組織歸入EP管中脫蠟醇化，加入裂解液55℃水浴過(guò)夜，蛋白酶K消化，沉淀洗鹽，取樣本行純度測(cè)定，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增純化由上海碧云天生物技術(shù)有限公司利用軟件Premier5.0設(shè)計(jì)PCR引物序列如下BRAF基因第15號(hào)外顯子上游引物5’-CTCTTCCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3’下游引物5’-GTGAGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3’擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為318bp。PCR反應(yīng)體系50 μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；降至4℃結(jié)束反應(yīng)。于美國(guó)BIO-RAD 580BR PCR儀器上進(jìn)行基因擴(kuò)增。用純化試劑盒將PCR產(chǎn)物純化。取5 μ/PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下檢測(cè)觀察，照相存盤。

1.2.3DNA分子直接測(cè)序?qū)z測(cè)有單一條帶的樣本送公司測(cè)序，經(jīng)人工校對(duì)記錄后用DNAMAN6.0軟件與基因庫(kù)BRAF基因序列比較結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用log-Rank檢驗(yàn)行生存分析。

2　結(jié)果

2.1癌組織中BRAF基因突變情況

癌組織中BRAF基因突變率為(15/166)9.04%。癌旁正常腸組織無(wú)基因突變。15外顯子上突變類型有5種V600E(T1799A，GTG >GAG) 11例，V600G (T1799G，GTG >GGG) 2例，V600S (G1798T、T1799C，GTG>TCG)1例，T598I (C1793T，ACC>ATC)2例，L594P (T1781C C1782A，CTC>CCA) 1例。常見(jiàn)突變類型為BRAF-V600E(11/15），有1例第014號(hào)標(biāo)本是多位點(diǎn)串聯(lián)突變。

2.2癌組織BRAF基因突變與臨床病理無(wú)相關(guān)性分析

癌組織BRAF基因突變組織分級(jí)低12.09%（11 /91）的患者較組織分級(jí)高5.33%（4/75）患者突變率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.79，P<0.05)。有淋巴轉(zhuǎn)移患者12.37 % (13/97)突變率較無(wú)轉(zhuǎn)移2.90%（2/69）患者突變率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.85，P< 0.05)。癌組織中患者浸潤(rùn)深度（χ2=1.94，P>0.05）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2= 1.74，P>0.05）的BRAF基因突變率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3癌組織BRAF基因突變5年生存情況

隨訪60月生存情況患者5年生存率54.8%(91/166)，失訪5人，MST47.5個(gè)月。癌組織有突變型患者15例，死亡11例。MST 38.1個(gè)月。野生型患者151例，死亡64例。MST 48.6個(gè)月。虛線表示突變的患者隨著生存時(shí)間增加，它的生存率比實(shí)線野生型患者下降明顯，采用log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析（χ2=7.317，P= 0.007），圖1示兩條生存曲線明顯分開(kāi),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　癌組織中BRAF基因突變狀態(tài)與患者生存率

3　討論

該研究檢測(cè)癌組織中BRAF基因突變率(15/166)9.04%，高靜等也檢測(cè)了966例CRC患者BRAF基因突變率7.4%,考慮與實(shí)驗(yàn)樣本量多少及檢測(cè)方法特異靈敏度等存在差異，都符合目前文獻(xiàn)4%～13%[6]。有73.33%(11/15）BRAF-V600E突變?yōu)槌Ｒ?jiàn)類型。由于大多數(shù)病人術(shù)后3～5年會(huì)有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，專家建議早期檢測(cè)KRAS、BRAF等基因突變情況指導(dǎo)臨床用藥[7]。BRAF基因突變型與野生型生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.317,P<0.05)，兩條生存曲線明顯分開(kāi)，隨著生存時(shí)間延長(zhǎng)生存率明顯下降，腫瘤分化程度越低、有淋巴轉(zhuǎn)移患者中突變率較高提示患者腫瘤惡性程度越高、分期都較晚復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)大，治療效果差預(yù)后不良[5-6]。腫瘤的發(fā)生由復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控，所有信號(hào)通路之間存在相互交叉，破壞某一通路阻斷某個(gè)激酶就能阻斷信息傳導(dǎo)是不客觀的。陳慧等[2]論述說(shuō)明除了BRAF基因外其它途徑等也可以調(diào)控EGFR信號(hào)通路激活形成腫瘤。李森朋等[3]論述沒(méi)有一種腫瘤只存在一個(gè)治療靶點(diǎn),往往是多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)起作用,也是目前臨床靶向治療耐藥的主要原因。開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)藥物和細(xì)胞毒藥物聯(lián)合用藥，隨著患者生存時(shí)間延長(zhǎng)，藥物的毒副作用也明顯，生存質(zhì)量得不到提高，因經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重而放棄用藥，是目前CRC死亡率居高不下的主要原因。因此隨著B(niǎo)RAF基因臨床耐藥和不良預(yù)后的預(yù)測(cè)性指標(biāo)相關(guān)研究不斷深入發(fā)展[8]，如何阻斷BRAF/ MAPK信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌患者的治療和預(yù)后的影響仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述, BRAF基因突變研究短短幾年，目前的基因檢測(cè)手段及分子靶向治療藥物費(fèi)用昂貴，為了減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高靶向治療效果，該研究希望能促進(jìn)患者在選擇治療方案前早期檢測(cè)相關(guān)基因狀態(tài)了解復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)做好藥敏試驗(yàn)，為臨床用藥提供準(zhǔn)確理論依據(jù)，相信未來(lái)靶向藥物更加合理地應(yīng)用臨床，腫瘤的個(gè)體化治療真正由理想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，造福于廣大結(jié)直腸癌患者。

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The Significance of BRAF Genetic Mutations for the Clinical Treatment and Prognosis of Colorectal Cancer Patients

WU Jie
Department of Gastroenterology,the Second People’s Hospital of Mudanjiang, Mudanjiang, Heilongjiang Province, 157013 China

[Abstract]Objective To study the significance of BRAF genetic mutations for clinical treatment and prognosis of colorectal cancer patients. Methods 161 specimens of rectal adenocarcinoma and 61 normal tissues near the cancer from diagnose and surgery of the pathology department during January 2009 and December 2009 were selected. BRAF genetic mutations were detected by PCR-DNA sequencing. The pathological data was recorded and the follow-up of 60-months-survival rate was performed. Results 1. In the rectal adenocarcinoma, BRAF genetic mutations rate was 9.04% and BRAF-V600E was the most common type, and no mutations was found in the normal tissues near the cancer. 2. The mutations rate was higher in patients in lower histological grade than those in higher histological grade, in patients with lymphatic metastasis than those without lymphatic metastasis, and the differences were statistically significant (P<0.05); however, there were no correlation between mutations rate and gender, age, pathogenic sites, as well as distant metastasis(P>0.05). 3. The survival rates of patients with BRAF Mutation were lower than those with wild type BRAF, and the difference in survival curves was statistically significant(P<0.05). Conclusion In patients with colorectal cancer, the BRAF genetic mutations rate was higher in the rectal adenocarcinoma than in the tissues near the cancer, and it is closely related with histological grades and lymphatic metastasis but negatively correlated with the survival rate and heralds a poor prognosis.

[Key words]Colorectal cancer; BRAF; Clinical treatment

[中圖分類號(hào)]R4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-0742（2015）07（c）－0055-02

[作者簡(jiǎn)介]伍潔（1973-），女，黑龍江牡丹江人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤內(nèi)科臨床治療研究工作。

收稿日期：（2015-04-29）