徐海和

miR-29b的作用靶點(diǎn)及其對(duì)Huh7細(xì)胞增殖及凋亡的干預(yù)作用

徐海和

目的 探討miR-29b（microRNA-29b）的作用靶點(diǎn)及其對(duì)肝腫瘤細(xì)胞系Huh7細(xì)胞增殖及凋亡的干預(yù)作用。方法 熒光定量PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞系LO2及肝癌細(xì)胞系Huh7的miR-29b和Mcl-1表達(dá)水平。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Mcl-1基因是否受microRNA調(diào)控。將miR-29b模擬物通過Lipofectamine 2000順時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測(cè)miR-29b對(duì)Mcl-1表達(dá)水平的影響。MTT法檢測(cè)miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響。Annexin V/PI染色法檢測(cè)miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 肝腫瘤細(xì)胞相比于正常肝細(xì)胞高表達(dá)Mcl-1（3.42±0.15比1.00±0.04，P＜0.05）低表達(dá)miR-29b（0.43±0.04比1.00±0.06，P＜0.05），在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29b可使Mcl-1的表達(dá)水平下降（0.37±0.03比1.03±0.07，P＜0.05），轉(zhuǎn)染miR-29b可抑制Huh7細(xì)胞的增殖（0.85±0.11比1.68±0.17，P＜0.05）并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［（28.4±2.10）%比（3.6±0.06）%，P＜0.05］。結(jié)論 MiR-29b下調(diào)Huh7細(xì)胞Mcl-1蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

肝腫瘤；Huh7；Mcl-1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；miR-29b

MicroRNA（miRNA）是一類高度保守的小RNA，通過與其靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因的蛋白表達(dá)[1-2]。miRNA被證實(shí)在細(xì)胞的各種生理活動(dòng)中都發(fā)揮重要的作用，miRNA表達(dá)的失調(diào)是細(xì)胞癌變的重要特征[3-4]。肝癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，預(yù)后差，在全球死于癌癥及其并發(fā)癥的統(tǒng)計(jì)中，肝癌死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[5]。然而，肝癌的發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚，一些細(xì)胞保護(hù)性蛋白的高度表達(dá)可能是癌變細(xì)胞抵抗程序性死亡并發(fā)展為腫瘤細(xì)

胞的重要原因[6]。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員，文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，Mcl-1高度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞逃避程序性死亡的重要機(jī)制，并且也是腫瘤細(xì)胞對(duì)一些化療藥物耐藥的重要機(jī)制。文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道，miR-29在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，miR-29具有良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的生物效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-29b靶向于Mcl-1 mRNA的3'-UTR區(qū)，轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材 料 人肝癌細(xì)胞株Huh7和人正常肝細(xì)胞系LO2為本院臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.2 試 劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司（產(chǎn)品號(hào)：11875-093）。miR-29b模擬物及對(duì)照RNA購(gòu)自廣州銳博生物有限公司，序列如下：miR-29b模擬物：5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；對(duì)照RNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。噻唑藍(lán)（MTT，產(chǎn)品號(hào)：M2128）、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：APOAF）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。Lipofectamine2000（產(chǎn)品號(hào)：11668030）、Trizol（產(chǎn)品號(hào)：15596-018）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（產(chǎn)品號(hào)：2641A）、SYBR Green（產(chǎn)品號(hào)：RR086A）購(gòu)于日本TaKaRa。逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR所需引物由上海生工有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Huh7細(xì)胞及LO2細(xì)胞miR-29b和Mcl-1表達(dá)水平 總RNA用TRIzol試劑提取，miR-29b采用特異性莖環(huán)引物法[11]進(jìn)行miR-29b的逆轉(zhuǎn)錄，miR-29b逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GAACACTGA-3′。Mcl-1直接用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，操作步驟照試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用SYBR Green試劑按照說明書進(jìn)行處理并在 Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，Mcl-1基因以GAPDH mRNA作為內(nèi)參，miR-29b以U6 small nuclear RNA（snRNA U6）作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析Mcl-1和miR-29b的相對(duì)表達(dá)[12]。定量PCR引物序列見表1。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將Huh7細(xì)胞按5000個(gè)數(shù)目接種于96孔板中培養(yǎng)12h，按操作說明書將miR-29b（5pmol/孔）或?qū)φ誖NA（5pmol/孔）用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入Huh7細(xì)胞，培養(yǎng)24h，對(duì)照組不做任何處理培養(yǎng)24h，之后加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞的增殖情況以O(shè)D570表示，OD570越高說明細(xì)胞增殖情況越良好。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將Huh7細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿板面70%左右面積，按操作說明書將miR-29b（100pmol/孔）或?qū)φ誖NA（100pmol/孔）用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入Huh7細(xì)胞，培養(yǎng)24h，對(duì)照組不做任何處理培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，按照試劑說明書將PI和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞越多，說明細(xì)胞凋亡程度越大。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s） 表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞Mcl-1和miR-29b表達(dá)情況 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝腫瘤細(xì)胞相比于正常肝細(xì)胞高表達(dá)Mcl-1，低表達(dá)miR-29b，兩者存在反比關(guān)系。見表2。

表2 肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞Mcl-1和miR-29b表達(dá)水平比較（±s）

表2 肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞Mcl-1和miR-29b表達(dá)水平比較（±s）

注：與LO2細(xì)胞比較，*P＜0.05

LO2細(xì)胞Huh7細(xì)胞33 1.00±0.04 3.42±0.15* 1.00±0.06 0.43±0.04*

3.2 miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞Mcl-1表達(dá)水平的影響

使用TargetScan工具（http：//www.targetscan.org）預(yù)測(cè)Mcl-1調(diào)控microRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA 3'-UTR存在miR-29b作用靶點(diǎn)（AUGGUGCUA，Mcl-1 3'-UTR的第1328到1336個(gè)堿基）。為了明確驗(yàn)證miR-29b調(diào)控Mcl-1的表達(dá)水平，將miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后檢測(cè)Mcl-1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物相比于轉(zhuǎn)染對(duì)照RNA可顯著降低Mcl-1mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），表明miR-29b確實(shí)能下調(diào)Mcl-1水平。見圖1、表3。

圖1 Mcl-1 3'-UTR存在miR-29b的結(jié)合位點(diǎn)

表3 miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞Mcl-1表達(dá)水平的影響（±s）

表3 miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞Mcl-1表達(dá)水平的影響（±s）

注：與對(duì)照RNA組比較，*P＜0.05

孔數(shù)miR-29b（pmol/孔）組別對(duì)照組對(duì)照RNA組miR-29b組333 00 100對(duì)照RNA（pmol/孔）0 100 0 Mcl-1 1.00±0.05 1.03±0.07 0.37±0.03*

3.3 MiR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響

采用MTT法檢測(cè)Huh7細(xì)胞在miR-29b治療下的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-29b組相比于對(duì)照RNA組，細(xì)胞增殖顯著降低（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照RNA組比較，miR-29b組細(xì)胞凋亡水平明顯提高（P＜0.05）。結(jié)果提示miR-29b可能通過下調(diào)Mcl-1表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。見表4。

表4 miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表4 miR-29b對(duì)Huh7細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與對(duì)照RNA組比較，*P＜0.05

對(duì)照組對(duì)照RNA組miR-29b組333 00 100 0 100 0 1.85±0.15 1.68±0.17 0.85±0.11* 2.6±0.04 3.6±0.06 28.4±2.10*

4 討論

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，Mcl-1在人類各種腫瘤細(xì)胞系中均高度表達(dá)，有文獻(xiàn)表明，在肝細(xì)胞中Mcl-1的過表達(dá)是一個(gè)腫瘤特異性改變。將腫瘤細(xì)胞的Mcl-1基因沉默后會(huì)引起腫瘤細(xì)胞自發(fā)性凋亡，但不影響正常肝細(xì)胞[13-14]。Mcl-1對(duì)其他類型的腫瘤也起著十分重要的作用，通過下調(diào)細(xì)胞Mcl-1的水平可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[15]。這些研究都提示，Mcl-1可以作為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

MicroRNAs是一種生物效應(yīng)很強(qiáng)的小分子核酸，在細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)參與細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)。研究表明microRNAs表達(dá)的改變往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，一些特定的microRNAs還被用作腫瘤診斷及預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果表明miR-29b的表達(dá)在Huh7細(xì)胞中相比于正常肝細(xì)胞系顯著下降，而Mcl-1基因在Huh7細(xì)胞中相比于正常肝細(xì)胞系表達(dá)顯著升高（P＜0.05），兩者存在反比關(guān)系。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-29b通過與Mcl-1 mRNA 3'-UTR的結(jié)合，下調(diào)Huh7細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)（P＜0.05）。此外，在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29b可抑制Huh7（P＜0.05）細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且誘導(dǎo)其凋亡（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示，miR-29b具有抗肝腫瘤的作用，miR-29b-Mcl-1途徑可能成為一個(gè)新的治療肝細(xì)胞肝癌的重要靶點(diǎn)。

［1］Phuah NH，Nagoor NH.Regulation of MicroRNAs by Natural Agents：New Strategies in Cancer Therapies［J］.Biomed Res Int，2014，2014：804510.

［2］Winter J，Jung S，Diederichs S，et al.Many roads tomaturity：microRNA biogenesis pathways and their regulation［J］.Nat Cell Biol，2009，11（3）：228-234.

［3］Saumet A，Mathelier A，Lecellier CH.The Potentialof Micro-RNAs in Personalized Medicine against Cancers［J］.Biomed Res Int，2014，2014：642916.

［4］Jeong HC.Clinical Aspect of MicroRNA in Lung Cancer［J］. Tuberc Respir Dis（Seoul），2014，77（2）：60-64.

［5］Siegel R，Naishadham D，Jemal A，et al.Cancer statistics 2012［J］.CA Cancer JClin，2012，62（1）：10-29.

［6］Seow TK，Liang RC，Chung MC，et al.Hepatocellular carcinoma：from bedside to proteomics［J］.Proteomics，2001，1（10）：1249-1263.

［7］Li X，Zeng X，Liu F.Imperatorin induces Mcl-1 degradation to cooperatively trigger Bax translocation and Bak activation to suppress drug-resistanthuman hepatoma［J］.Cancer Lett，2014，348（1-2）：146-155.

［8］Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［9］Gong J，Li J，Yu J，et al.Characterization of microRNA-29 family expression and investigation of their mechanistic roles in gastric cancer［J］.Carcinogenesis，2014，35（2）：497-506.

［10］Rostas JW，Pruitt HC，Samant RS.microRNA-29 negatively regulates EMT regulator N-myc interactor in breast cancer［J］.Mol Cancer，2014，13：200.

［11］Chen C，Ridzon DA，Lee DH，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（20）：e179.

［12］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［13］Thallinger C，Wolschek MF，Monia BP，et al.Mcl-1 is a novel therapeutic target for human sarcoma：synergistic inhibition of human sarcoma xenotransplants by a combination ofmcl-1 antisense oligonucleotideswith low-dose cyclophosphamide［J］.Clin Cancer Res，2004，10（12 pt1）：4185-4191.

［14］Opferman JT，Iwasaki H，Akashi K，et al.Obligate role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells［J］.Science，2005，307（5712）：1101-1104.

［15］Mattoo AR，Zhang J，Jessup JM，et al.Inhibition of NANOG /NANOGP8 down regulates MCL-1 in colorectal cancer cells and enhance the therapeutic efficacy of BH3 mimetics［J］.Clin Cancer Res，2014，20（21）：5446-5455.

［16］Shin VY，Chu KM.MiRNA aspotentialbiomarkersand therapeutic targets for gastric cancer［J］.World JGastroenterol，2014，20（30）：10432-10439.

（收稿：2014-10-01 修回：2014-11-04）

Targets of m iR-29b and Its Effect on Proliferation and Apoptosis of Huh7 Cells

XU Haihe.Clinical Labo- ratory,Jiangshan People's Hosital,Jiangshan(324100),China

Objective To investigate the therapeutic targets of miR-29b and its effect on proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cell line Huh7.M ethods The expression of Mcl-1 and miR-29b in normal liver cell line LO2 and hepatocellular carcinoma cell line Huh7 was detected by qPCR.The putative binding sites of Mcl-1 gene was analyzed by using bioinformatic method.MiR-29b was transfected into Huh7 cells by Lipofectamine 2000, then the expression of Mcl-1 was detected.The cell growth was assessed by MTT after Huh7 cells transfected with miR-29b mimics.The apoptosis of cells was measured by Annexin V/PI staining.Results Compared with normal liver cells,Huh7 cells had higher expression of Mcl-1（3.42±0.15 vs 1.00±0.04,P＜0.05）and lower expression of miR-29b（0.43±0.04 vs 1.00±0.06,P＜0.05）.Transfection of miR-29b mimics suppressed Mcl-1 expression in Huh7 cells（0.37±0.03 vs 1.03±0.07,P＜0.05）and inhibited the proliferation of Huh7 cells（0.85±0.11 vs 1.68±0.17,P＜0.05）while inducing apoptosis in Huh7 cells[（28.4±2.1）%vs（3.6±0.06）%,P＜0.05].Conclusion MiR-29b downregulates the expression of Mcl-1 protein inducing apoaptosis in Huh7 cells.

Hepatocellular carcinoma;Huh7;Mcl-1;Cell proliferation;Apoptosis;miR-29b

浙江省江山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江山 324100）