宋　杰，胡陽黔，劉　堅，李　靜△(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院，基礎醫(yī)學院，湖北十堰44000)

黃芪多糖通過活化AMPK-eNOS信號通路減輕游離脂肪酸對人血管內(nèi)皮細胞的損傷*

宋杰1，胡陽黔1，劉堅2，李靜2△
(湖北醫(yī)藥學院1附屬東風醫(yī)院，2基礎醫(yī)學院，湖北十堰442000)

［摘要］目的:研究黃芪多糖對游離脂肪酸所誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用及機制。方法:培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞( HUVECs)，實驗分為正常對照組、黃芪多糖組［黃芪多糖( 200 mg/L)處理24 h］、游離脂肪酸組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)共同處理24 h］、游離脂肪酸加黃芪多糖組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)和黃芪多糖( 200 mg/ L)共同處理24 h］和compound C組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)、黃芪多糖( 200 mg/L)及AMPK阻斷劑compound C ( 10 μmol/L)處理24 h］。采用MTT法檢測細胞活性，硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液中一氧化氮( NO)含量，Western blot法測細胞總腺苷酸活化蛋白激酶( AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶( p-AMPK)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶( eNOS)及磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶( p-eNOS)的蛋白水平。結(jié)果:黃芪多糖組各項指標較正常對照組無顯著差異。MTT結(jié)果顯示游離脂肪酸組的細胞活性較正常對照組明顯下降，游離脂肪酸加黃芪多糖組的細胞活性較游離脂肪酸組明顯好轉(zhuǎn)，compound C組的細胞活性與游離脂肪酸組無顯著差異。游離脂肪酸組的NO含量及p-AMPK、p-eNOS水平較對照組明顯減少，黃芪多糖能顯著抑制游離脂肪酸所致的NO含量及p-AMPK、p-eNOS水平的減少，compound C則可阻斷黃芪多糖的作用。各組AMPK及eNOS表達均無明顯差異。結(jié)論:黃芪多糖可以減輕游離脂肪酸誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制與AMPK-eNOS信號通路有關。

［關鍵詞］黃芪多糖;腺苷酸活化蛋白激酶;內(nèi)皮一氧化氮合酶;游離脂肪酸;一氧化氮

目前研究認為血漿游離脂肪酸( free fatty acid，F(xiàn)FA)升高是導致代謝綜合征患者血管內(nèi)皮細胞損害和功能異常的重要因素。王意君等［1］對“離體器官”的研究發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸對主動脈內(nèi)皮功能有損傷作用，而黃芪可以緩解高游離脂肪酸對血管內(nèi)皮功能的損傷。然而其機制尚未闡明，故本研究在上述研究基礎上深入細胞水平探討游離脂肪酸和黃芪有效活性成分黃芪多糖( Astragalus polysaccharides，APS)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的影響及機制，為開發(fā)血管內(nèi)皮保護藥物和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供實驗和理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑和儀器

HUVECs購自ATCC;優(yōu)化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS( 80～120 kD) (湖北中醫(yī)學院藥用植物鑒定教研室鑒定)［2］;一氧化氮( nitric oxide，NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;長鏈游離脂肪酸購自Sigma;腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activated protein kinase，AMPK)抗體、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶( phosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK)抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、磷酸化一氧化氮合酶( phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS)抗體均購自Upstate。BCA protein assay kit購自Pierce; Western blot試劑盒購自KPL。

2細胞培養(yǎng)與分組

HUVECs采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。實驗分5組:正常對照( control)組、黃芪多糖組［黃芪多糖( 200 mg/ L)［2-3］處理24 h］、游離脂肪酸組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)［2-3］處理24 h］、游離脂肪酸加黃芪多糖組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)和黃芪多糖( 200 mg/ L)共同處理24 h］和compound C組［游離脂肪酸( 0. 25 mmol/L)加黃芪多糖( 200 mg/L)及AMPK阻斷劑compound C ( 10 μmol/L)處理24 h］。

3實驗方法

3.1MTT實驗取生長良好的HUVECs，以濃度2. 0×107/L的細胞懸液接種96孔培養(yǎng)板中，每個實驗組種8孔，每孔接種100 μL，培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，按實驗分組加入相應培養(yǎng)液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)。在24 h時相點前4 h各取1塊培養(yǎng)板，每孔加入濃度為5 g/L的MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后向每孔加入20% DMSO 100 μL，振蕩后在酶標儀上以490 nm波長測吸光度。

3.2NO含量測定采用硝酸還原酶法按說明書步驟測定細胞上清液中NO含量。取細胞培養(yǎng)液0. 1 mL按說明書要求加入試劑1和2，37℃水浴60 min，加入試劑3、4，室溫靜置40 min，3 500～4 000 r/min離心10 min后取上清液0. 5 mL，加入顯色劑，靜置10 min，550 nm波長、1 cm光徑比色。

3.3Western blot檢測將處理后的細胞，用PBS沖洗，冰上充分裂解后，置4℃超速離心機，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉、漂洗后加入Ⅰ抗于4°C孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔Ⅱ抗( 1∶800)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細胞測量程序的圖形分析軟件系統(tǒng)測出相對吸光度值。

4統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差( mean±SD)表示，并采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件處理，組間差異比較用單因素方差分析，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 MTT實驗檢測HUVECs的活性

游離脂肪酸組細胞活性較正常對照組明顯下降( P＜0. 05)，游離脂肪酸加黃芪多糖組細胞活性較脂肪酸組明顯升高( P＜0. 05)，compound C組細胞活性與游離脂肪酸組無顯著差異，見表1。

表1　黃芪多糖和游離脂肪酸對HUVECs活性的影響Table 1.The effects of APS and FFA on the viability of HUVECs ( Mean±SD.n =8)

2 黃芪多糖對NO含量的影響

游離脂肪酸組NO含量較對照組明顯減少( P＜0. 05)，游離脂肪酸加黃芪多糖組較游離脂肪酸組NO含量明顯增加( P＜0. 05)，compound C組NO含量與游離脂肪酸組無顯著差異，見圖1。

Figure 1.The effects of APS and FFA on NO content in the culture medium of HUVECs.Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs control group;#P＜0. 05 vs FFA group;△P＜0. 05 vs FFA + APS group.圖1　黃芪多糖和游離脂肪酸對HUVECs培養(yǎng)上清液一氧化氮含量的影響

3 黃芪多糖對各種蛋白水平的影響

游離脂肪酸組的p-AMPK和p-eNOS蛋白水平較對照組明顯減少( P＜0. 05)，游離脂肪酸加黃芪多糖組較游離脂肪酸組的p-AMPK和p-eNOS蛋白水平明顯增加( P＜0. 05)，compound C組的p-AMPK 和p-eNOS蛋白水平與游離脂肪酸組無顯著差異。各組的AMPK及eNOS蛋白水平均無明顯差異，見圖2。

討論

血管內(nèi)皮細胞不僅是循環(huán)血液和血管平滑肌細胞間的機械屏障，而且是人體最大的內(nèi)分泌和旁分泌器官。作為機械屏障，它很容易受到體內(nèi)外各種理化因素的損傷;機械屏障受損傷后血管內(nèi)皮細胞將出現(xiàn)內(nèi)分泌功能失調(diào)，使其分泌的多種活性物質(zhì)或與這些活性物質(zhì)相關的其它物質(zhì)之間的平衡被打破，從而導致心血管系統(tǒng)功能障礙［4］。國內(nèi)外多項研究表明［4-5］，循環(huán)中游離脂肪酸水平升高，可通過炎癥反應及氧化應激等導致機械屏障損傷，進而引起血管內(nèi)皮功能受損。

Figure 2.The effects of APS on the protein levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase ( AMPK)，phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase ( p-AMPK)，endothelial nitric oxide synthase ( eNOS) and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase ( p-eNOS).Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs control group;#P＜0. 05 vs FFA group;△P＜0. 05 vs FFA + APS group.圖2　APS對AMPK、p-AMPK、eNOS和p-eNOS蛋白水平的影響

血液中游離脂肪酸水平升高導致的脂毒性與代謝綜合征密切相關，而目前抗脂毒性的藥物很少。我們近期研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物黃芪多糖在骨骼肌細胞、巨噬細胞、胰島β細胞均具有抗游離脂肪酸脂毒性的作用［3，6-7］，表明黃芪多糖將很可能成為抗脂毒性的新藥。血液中游離脂肪酸對血管內(nèi)皮細胞具有更加直接的損傷作用，然而目前關于游離脂肪酸損傷血管內(nèi)皮細胞以及黃芪多糖抗游離脂肪酸損傷血管內(nèi)皮的研究很少。王意君等［1］在離體器官水平研究了黃芪多糖和游離脂肪酸對主動脈“血管環(huán)”舒張功能和一氧化氮釋放量的影響，證實黃芪多糖具有改善游離脂肪酸對血管壁功能損傷的作用。該研究僅從血管內(nèi)皮組織舒張功能角度進行了探索，而實驗中對“血管環(huán)”釋放的NO含量檢測可能不能真實反映“血管內(nèi)皮細胞”所釋放的NO的含量;并且對其機制研究不深入。本研究在上述研究基礎上，為減少多種不相關因素對實驗結(jié)果的影響，從細胞水平上探索了黃芪多糖抗游離脂肪酸對血管內(nèi)皮細胞脂毒性的作用及其機制。

血管內(nèi)皮細胞分泌的多種活性物質(zhì)中，NO是具有較多生物活性的信號分子。NO可通過旁分泌的形式作用于血管壁及管腔，調(diào)節(jié)血管張力及血流速度，抑制平滑肌增殖和血管炎癥，防止血小板黏附和血栓的形成; NO對于血管功能調(diào)節(jié)具有非常重要的作用，故而NO被視為反映血管內(nèi)皮功能的重要標志物之一［8-9］。NO生理范圍內(nèi)生成增多可發(fā)揮保護血管內(nèi)皮細胞的作用，同時也表明血管內(nèi)皮細胞分泌功能良好［9-11］。所以本研究通過檢測培養(yǎng)液中NO含量反映血管內(nèi)皮細胞的功能。線粒體是脂肪酸氧化的場所，在先前研究中我們證實黃芪多糖可以修復高游離脂肪酸損傷的線粒體［3］，本研究通過MTT法檢測細胞活性，其結(jié)果同時也反映了線粒體的功能。實驗中分別給予游離脂肪酸和黃芪多糖對人血管內(nèi)皮細胞進行干預，NO含量結(jié)果表明黃芪多糖可有效地對抗游離脂肪酸導致的NO生成減少，說明黃芪多糖可以改善游離脂肪酸對血管內(nèi)皮細胞功能的損害。MTT結(jié)果證實黃芪多糖具有抗游離脂肪酸損傷內(nèi)皮細胞活性的作用。NO生理范圍內(nèi)增加對血管內(nèi)皮細胞具有保護作用［10-11］，結(jié)合先前研究［3］結(jié)果分析黃芪多糖很可能是通過修復損傷的線粒體發(fā)揮其保護內(nèi)皮細胞的作用;同時NO生理范圍內(nèi)增加也促進了細胞活性的恢復。

黃芪多糖是通過什么機制影響NO生成的?報道證實，NO是由左旋精氨酸和氧分子經(jīng)過一氧化氮合成酶( nitric oxide synthase，NOS)催化氧化而成，NOS有結(jié)構(gòu)型NOS、神經(jīng)元型NOS、線粒體型NOS以及內(nèi)皮型NOS。在內(nèi)皮細胞中NO主要是由eNOS介導催化生成，eNOS作為血管內(nèi)皮保護因子通過調(diào)節(jié)NO生物合成發(fā)揮作用［9，12］。AMPK、蛋白激酶B等多種蛋白激酶參與eNOS磷酸化的調(diào)節(jié)。其中AMPK是真核細胞能量代謝的一種非常重要的關鍵酶，被稱為“能量代謝總開關”，它與游離脂肪酸代謝密切相關。近期有證據(jù)表明AMPK對eNOS有重要的調(diào)節(jié)作用: Cao等［13］研究證實二甲雙胍通過抑制雌性大鼠主動脈平滑肌細胞AMPK-eNOS-NO途徑抑制血管鈣化; Li等［14］研究證實通心絡可通過AMPK/eNOS途徑減少缺氧導致的骨髓間充質(zhì)干細胞的凋亡; Lee等［15］研究表明二十碳五烯酸通過激活AMPK/eNOS通路抗棕櫚酸誘導的血管內(nèi)皮功能障礙; Zhang等［16］研究表明小檗堿通過上調(diào)AMPK和eNOS及下調(diào)NOX4改善棕櫚酸誘導的內(nèi)皮功能障礙。

已經(jīng)被證實為AMPK激活劑［3，6-7］的黃芪多糖是否可以通過類似的機制抗游離脂肪酸對內(nèi)皮細胞的損傷?本研究分別給予游離脂肪酸和黃芪多糖對血管內(nèi)皮細胞進行干預后，檢測了AMPK和eNOS及其磷酸化蛋白的表達，結(jié)果表明游離脂肪酸可抑制AMPK-eNOS通路，而黃芪多糖可激活被抑制的通路;加用AMPK阻斷劑compound C后，黃芪多糖活化AMPK-eNOS通路的作用被阻斷。上述研究表明，游離脂肪酸可以抑制AMPK-eNOS通路，而黃芪多糖可以活化被抑制的AMPK進而激活eNOS。eNOS的活化狀態(tài)影響了培養(yǎng)液中NO的含量。該實驗進一步明確了黃芪多糖抗游離脂肪酸導致的血管內(nèi)皮細胞NO生成減少的機制。

綜上所述，黃芪多糖可以改善游離脂肪酸誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制與黃芪多糖活化被游離脂肪酸抑制的AMPK-eNOS信號通路有關。本研究進一步明確了黃芪多糖抗游離脂肪酸損傷內(nèi)皮細胞的作用及其機制，為黃芪多糖成為新的抗脂毒性藥物以及發(fā)現(xiàn)新的抗脂毒性靶點提供了實驗及理論依據(jù)。

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Astragalus polysaccharides protects against free fatty acid-induced human vascular endothelial cell dysfunction via AMPK-eNOS pathway

SONG Jie1，HU Yang-qian1，LIU Jian2，LI Jing2
(1Dongfeng Hospital，2Preclinical Medicine College，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China.E-mail: doctorsongjie@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the protective effect of Astragalus polysaccharides ( APS) on free fatty acid-induced injury in human umbilical vein endothelial cells ( HUVECs).METHODS: Cultured HUVECs were divided into control group，APS group［APS ( 200 mg/L) treated for 24 h］，free fatty acid group［free fatty acid ( 0. 25 mmol/L) treated for 24 h］，free fatty acid plus APS group［free fatty acid ( 0. 25 mmol/L) and APS ( 200 mg/L) treated for 24 h］，and compound C group［free fatty acid ( 0. 25 mmol/L) and APS ( 200 mg/L) and AMPK inhibitor compound C ( 10 μmol/L) treated for 24 h］.The cell viability was detected by MTT assay.Nitric oxide ( NO) content in the medium was determined by nitrate reductase assay.The protein levels of total adenosine monophosphate-activated protein kinase ( AMPK)，phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase ( p-AMPK)，endothelial nitric oxide synthase ( eNOS) and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase ( p-eNOS) were measured by Western blot.RESULTS: No significant difference of all indexes between APS group and control group was observed.The cell viability in free fatty acid group decreased significantly compared with control group.The cell viability in free fatty acid plus APS group was significantly improved as compared with free fatty acid group.The cell viability in compound C group was almost the same as that in free fatty acid group.The No content and protein levels of p-AMPK and p-eNOS in free fatty acid group decreased obviously asbook=1306,ebook=162compared with control group，while the NO content and protein levels of p-AMPK and p-eNOS in free fatty acid plus APS group increased obviously compared with free fatty acid group.No significant difference of the p-AMPK and p-eNOS protein levels between free fatty acid plus APS group and free fatty acid group was observed.No significant difference of the AMPK and eNOS protein levels in all groups was found.CONCLUSION: APS attenuates the free fatty acid-induced injury，and its mechanism is related to the AMPK-eNOS signal pathway.

［KEY WORDS］Astragalus polysaccharides; AMP-activated protein kinases; Endothelial nitric oxide synthase; Free fatty acid; Nitric oxide

通訊作者△Tel: 0719-8272543; E-mail: doctorsongjie@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目( No.30370673) ;湖北省教育廳科學技術研究計劃項目( No.B2013120; B2014062) ;十堰市科學技術研究與開發(fā)項目( No.ZD2012037)

［收稿日期］2014-12-05［修回日期］2015-04-10

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1305-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.027