熊萍香，周玉平，熊江琴，寧 安，周憲民，鄒節(jié)新，楊德平，林智平，胡美英

(1.南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330003； 2.江西省寄生蟲病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，南昌 330006)

血吸蟲病患者不同胃黏膜病變中Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達(dá)及臨床意義

熊萍香1，周玉平1，熊江琴1，寧 安2，周憲民3，鄒節(jié)新3，楊德平1，林智平1，胡美英1

(1.南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330003； 2.江西省寄生蟲病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，南昌 330006)

目的 探討鄱陽湖區(qū)域日本血吸蟲病患者Survivin、p53、E-cadherin的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義。方法選擇鄱陽湖區(qū)域確診為慢性與晚期血吸蟲病患者(151例)的胃黏膜標(biāo)本(其中萎縮性胃炎49例，胃黏膜異形增生30例，不完全性大腸上皮化生34例，胃癌38例)。應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)Survivin、p53、E-cadherin在正常黏膜、癌前病變、胃癌組織中的表達(dá)。結(jié)果 Survivin蛋白在正常胃黏膜組織壁細(xì)胞可見陽性表達(dá)，而其他細(xì)胞幾乎無表達(dá)。Survivin蛋白陽性表達(dá)率在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組分別為51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p53蛋白陽性表達(dá)率在正常胃黏膜、萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組分別為1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin蛋白在正常胃黏膜表達(dá)率為100.00%，在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌各組胃黏膜組織中陽性率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達(dá)與胃癌的組織分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM 分期有關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 Survivin、p53、E-cadherin蛋白可能參與血吸蟲患者胃癌病變的發(fā)生發(fā)展，可作為較理想的標(biāo)志物用于胃癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移預(yù)后的預(yù)警。

Survivin； p53； E-cadherin； 日本血吸蟲?。?癌前病變； 胃癌

日本血吸蟲病是嚴(yán)重危害人類身體健康的寄生蟲病。江西省鄱陽湖區(qū)是我國血吸蟲病重疫區(qū)[1-2]。本課題組前期研究資料[3]表明，血吸蟲病患者合并胃癌前病變(萎縮性胃炎、胃黏膜異形增生、不完全性大腸上皮化生)的發(fā)生率明顯高于非血吸蟲病患者。由于整個(gè)胃癌癌前發(fā)展過程是一個(gè)非常復(fù)雜的由進(jìn)行性和退行性變化組成的動(dòng)態(tài)過程，研究胃癌癌前和早期的基因變化對(duì)于了解該病發(fā)生的病理過程、進(jìn)而提出早期診斷和干預(yù)策略有重要意義。

現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因突變與異常表達(dá)。許多癌基因/抑癌基因表達(dá)失衡、細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，單個(gè)腫瘤相關(guān)基因發(fā)生的分子事件作用有限。Survivin是迄今研究發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，在人體各種腫瘤組織中均有Suvrvini蛋白的過量表達(dá)[4-5]。Survivin可能作為一種癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中最常見的一個(gè)突變基因，野生型p53 屬于腫瘤抑制基因，而突變型p53 基因抑制細(xì)胞凋亡，從而促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，允許腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[6]。E-cadherin 與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系是近年來腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞黏附分子E-eadherin蛋白是維持上皮細(xì)胞極性及細(xì)胞間連接的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞間黏附能力減弱，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[7-8]。

本研究將收集到的鄱陽湖區(qū)域血吸蟲病患者萎縮性胃炎、胃黏膜異形增生、不完全性大腸上皮化生及胃癌組織，利用組織芯片及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)癌基因Survivin、p53、E-cadherin的表達(dá)。觀察這些基因蛋白在正常黏膜、癌前病變、癌變組織的變化趨勢(shì)，并分析其與胃癌相關(guān)病理參數(shù)的關(guān)系，以深入而全面地揭示血吸蟲病患者合并胃癌及癌前病變復(fù)雜的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取南昌市第二醫(yī)院消化內(nèi)科于2009年5月至2012年1月期間收集的鄱陽湖區(qū)域確診為慢性與晚期血吸蟲病患者(151例)的胃黏膜標(biāo)本，男88例，女63例，患者年齡23～78歲，平均56.8歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查核實(shí)，其中萎縮性胃炎49例，胃黏膜異形增生30例，不完全性大腸上皮化生34例，胃癌38例。

選取同一個(gè)體胃鏡活檢取得的正常胃黏膜作為對(duì)照。參照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)病理學(xué)分類(pTNM)分期系統(tǒng)(2002版)的標(biāo)準(zhǔn)，pTNM分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。標(biāo)本使用均有患者的知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有病理標(biāo)本均經(jīng)病理科兩位以上醫(yī)師診斷證實(shí)。所有標(biāo)本均常規(guī)用10%中性甲醛固定，石蠟包埋制片。

1.2 組織芯片制作

HE染色、切片后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，確定胃黏膜病變組織的典型部位，并在切片上做好標(biāo)記，將切片與蠟塊一一對(duì)照，在蠟塊相應(yīng)的典型位置做出標(biāo)記，制備模板蠟塊(2 cm×4 cm)，用針頭在空白蠟塊上打孔(直徑1.5 mm)，并精確地排成微孔陣列。然后用自制特殊針頭穿取供體蠟塊已標(biāo)記區(qū)域獲取圓柱狀組織芯，再將組織芯轉(zhuǎn)移到受體蠟塊陣列孔內(nèi)，按照病例編號(hào)反復(fù)將組織芯整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。將組織芯片蠟塊以4～6 μm厚連續(xù)切片。

1.3 免疫組織化學(xué)

制作好的組織芯片采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體操作按照SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性組織切片作陽性對(duì)照。兔抗人p53多克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗E-cadherin及SP免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判定

所有病理切片和組織芯片均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生在不知病例臨床資料的前提下閱片，結(jié)果不一致時(shí)采取協(xié)商統(tǒng)一原則。對(duì)每張病理切片在200倍鏡下觀察4個(gè)不同視野。按各種陽性細(xì)胞占所得細(xì)胞總數(shù)的百分比，將其分為4個(gè)等級(jí)：陽性細(xì)胞≤5%為0分，5%<陽性細(xì)胞≤25%為1分，25%<陽性細(xì)胞≤50%為2分，50%<陽性細(xì)胞≤75%為3分，>75%為4分；陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度按計(jì)分方法：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)積分相乘為最終評(píng)分。0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+),5～8分為中度陽性(),9～12分為強(qiáng)陽性()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin蛋白在不同胃黏膜病變中的表達(dá)

Survivin蛋白在正常胃黏膜組織中僅壁細(xì)胞可見陽性表達(dá)，而其他細(xì)胞幾乎無表達(dá)。在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織中均可見Survivin蛋白不同程度表達(dá)。Survivin陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，部分定位于細(xì)胞核中，為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒。在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織中，Survivin蛋白陽性表達(dá)率分別為51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 Survivin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達(dá)

2.2 p53蛋白在不同胃黏膜病變中的表達(dá)

在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌患者的胃黏膜組織均可見p53陽性表達(dá)。p53陽性著色以細(xì)胞核為主，呈棕黃色顆粒狀。p53在正常黏膜組織、萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達(dá)率分別為1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 p53蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達(dá)

2.3 E-cadherin蛋白在不同胃黏膜病變中的表達(dá)

正常胃黏膜組織E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率為100%。E-cadherin主要表達(dá)在細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)中有少量表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀。E-cadherin蛋白在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達(dá)率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各組織間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 E-cadherin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病變組織中的表達(dá)

2.4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系見表4。由表4可見，在胃癌黏膜組織中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白表達(dá)與患者的年齡、性別無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與組織學(xué)分化、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)(均P<0.05)。組織分化程度越低，Survivin蛋白、p53蛋白陽性表達(dá)率越高，E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率越低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，Survivin蛋白、p53蛋白陽性率較高，E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率低；臨床病理分期越晚，Survivin蛋白、p53蛋白陽性表達(dá)率越高，E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率越低，表明Survivin蛋白、p53蛋白高表達(dá)，E-cadherin蛋白低表達(dá)提示胃癌不良預(yù)后。

表4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

表4(續(xù))

3 討論

血吸蟲病與結(jié)腸癌、肝癌等相關(guān)，已為科學(xué)工作者所共識(shí)?；谧匀慌c社會(huì)諸多因素的影響，鄱陽湖是我國血吸蟲病流行最為嚴(yán)重的區(qū)域之一。本課題組于2009年1月至2010年1月對(duì)鄱陽湖血吸蟲疫區(qū)6縣共19個(gè)自然村453例自愿者進(jìn)行胃鏡檢查，并且在胃竇、胃角、胃體和球腔等部位的可疑病灶處取材進(jìn)行病理檢查，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血吸蟲病患者胃癌的前期病變的發(fā)生率明顯高于非血吸蟲病患者[3]。

胃癌是常見的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)生發(fā)展是個(gè)多階段過程，涉及許多基因突變與異常表達(dá)，并與細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡相關(guān)。由于單一腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)往往意義較小，難于全面評(píng)估。組織芯片為病理學(xué)提供了一種高通量、大樣本以及快速的分子水平的分析工具。構(gòu)建胃癌組織芯片進(jìn)行多基因表達(dá)檢測(cè)具有十分重要的意義，并具有明顯優(yōu)勢(shì)。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成員，在人類很多惡性腫瘤組織中都可檢測(cè)出Survivin的表達(dá)[4-5]。有研究[9]顯示，Survivin參與細(xì)胞周期調(diào)控，胃癌組織中Suvrivin基因大量表達(dá)可能導(dǎo)致凋亡調(diào)控機(jī)制失常而發(fā)生凋亡受阻，這將有助于癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示Survivin可能是一個(gè)腫瘤特異性的凋亡抑制因子，很可能成為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)記物和腫瘤基因治療的一個(gè)理想的靶基因。在本研究中，Survivin蛋白在胃癌前病變及胃癌中的陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織，并且其陽性表達(dá)率隨著癌變的進(jìn)展而顯著增加。同時(shí)，本研究結(jié)果也顯示，Suvrvini蛋白表達(dá)與組織分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)。組織分化程度越低，Survivin蛋白的表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期越晚，Survivin蛋白陽性表達(dá)率越高，提示Survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)特性、疾病分期和患者預(yù)后有關(guān)，Survivin可能是胃癌靶向治療的一個(gè)很好的位點(diǎn)。

抑癌基因p53是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因。它包括野生型和突變型兩種，其中野生型為腫瘤的抑制基因，突變型為腫瘤的致癌基因，前者的缺失突變或后者的過量表達(dá)均可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。p53蛋白的主要生物學(xué)功能包括引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)分化等[10]。本研究組織芯片結(jié)果顯示，正常胃黏膜p53表達(dá)率低，在胃癌前病變和胃癌黏膜組織中均可見p53陽性表達(dá)，且隨惡性程度增加呈逐漸升高趨勢(shì)。同時(shí)，p53陽性表達(dá)與胃癌的臨床病理特征關(guān)系的研究表明，p53蛋白表達(dá)陽性率在胃癌中隨組織學(xué)分化降低而升高，并且與胃癌浸潤相關(guān)。在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，p53蛋白表達(dá)陽性率顯著較高，且隨pTNM分期增高而顯著增加。表明p53基因突變是胃癌惡性轉(zhuǎn)化的重要事件，其陽性表達(dá)與胃癌進(jìn)展的病理形態(tài)學(xué)參數(shù)存在一定的相關(guān)性。

E-cadherin是一種跨膜糖蛋白，具有維持正常上皮完整性和極性的功能，當(dāng)E-cadherin表達(dá)降低或其他因素?fù)p害E-cadherin 黏附功能時(shí)，腫瘤細(xì)胞就易于脫離并逃離原發(fā)灶發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[11-12]。因此，E-cadherin的黏附功能喪失是細(xì)胞獲得低分化和高浸潤性的關(guān)鍵。有研究[13]顯示，將E-cadherin反義RNA導(dǎo)入高表達(dá)E-cadherin 腫瘤細(xì)胞株中，可明顯提高轉(zhuǎn)移力，提示E-cadherin確有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率為100.00%，而在萎縮性胃炎、不完全性大腸上皮化生、異型增生和胃癌的陽性表達(dá)率分別為83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，表明E-cadherin下調(diào)在胃癌前病變和胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，分化程度越差、浸潤越深，E-cadherin的陽性表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示其與腫瘤的分化、浸潤性、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于以上3種因素均為與患者預(yù)后相關(guān)的重要因素，因此，E-cadherin也可作為判斷腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上所述，在血吸蟲患者胃癌前病變及胃癌組織中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白的變化可能與癌變的發(fā)生發(fā)展、癌細(xì)胞的分化、腫瘤的增殖、侵襲及患者的預(yù)后有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：鐘榮梅)

2014-06-24

國家自然科學(xué)基金(81160207)；江西省衛(wèi)生廳普通科技計(jì)劃(贛衛(wèi)科教字【2011】29號(hào))

熊萍香(1962—)，女，學(xué)士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸疾病與消化內(nèi)鏡的研究。

熊江琴，主任醫(yī)師， E-mail：xiongjiangqin@sina.com。

R532.21

A

1009-8194(2015)03-0015-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.03.006