吳 霜,陳 韜,張冬怡,劉 劭,馬 寧

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

豬屠宰后正常肉與PSE肉中整聯(lián)蛋白變化與持水性的相關(guān)性

吳 霜,陳 韜*,張冬怡,劉 劭,馬 寧

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

采用蛋白印跡(Western blot)和組織學(xué)微觀測(cè)量技術(shù)測(cè)定豬宰后正常肉和PSE肉(Pale,Soft,Exudative)中整聯(lián)蛋白(integrin)降解情況和肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)變化,并分析integrin對(duì)肌肉持水性的影響。結(jié)果顯示:integrin在宰后逐步降解,正常肉和PSE(Pale,Soft,Exudative)肉樣integrin的降解量差異不顯著(p>0.05)。同組內(nèi)比較,正常組在宰后第24 h出現(xiàn)明顯降解(p<0.05);PSE組在宰后6 h出現(xiàn)顯著降解(p<0.05)。宰后2 d的integrin完整度與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),宰后兩組肉樣的肌肉細(xì)胞間隙面積呈顯著性增加(p<0.05),PSE組細(xì)胞間隙顯著高于正常組的細(xì)胞間隙面積。宰后豬肉樣品在宰后1、6、24 h的細(xì)胞間隙面積與汁液流失率呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:宰后integrin降解越少,細(xì)胞間隙面積越小,汁液流失率越小,肌肉持水力越強(qiáng)。

豬肉,持水性,整聯(lián)蛋白,細(xì)胞間隙,相關(guān)性

豬肉在屠宰后保持水分的能力稱為持水性(WHC,water holding capacity)。過高的汁液流失會(huì)導(dǎo)致持水性變低,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。很多復(fù)雜的因素如基因、擊暈方法、年齡、冷卻速率甚至蛋白質(zhì)的氧化都會(huì)影響肉類的持水性[1-5]。

一些研究指出整聯(lián)蛋白integrin的降解會(huì)影響宰后汁液流失[6-8]。integrin,亞基分子量為88 ku,由α和β亞基所組成[9-10]。integrin將細(xì)胞外基質(zhì)同細(xì)胞內(nèi)的骨架網(wǎng)絡(luò)連成一個(gè)整體[11]。如果在僵直開始后integrin不降解,肌原纖維之間的水分可能流入到肌細(xì)胞周圍的結(jié)締組織中,在結(jié)締組織良好的持水性性能作用下,水分滯留在結(jié)締組織中[12-13];宰后僵直收縮過程中肌原纖維之間擠出的水分可能進(jìn)入肌原纖維和細(xì)胞膜之間的通道中,所以肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮導(dǎo)致汁液流失。

已有研究的不足主要表現(xiàn)在并沒有研究正常肉與PSE肉中integrin完整度變化的差異性。基于此,本文研究?jī)煞N肉樣的integrin變化與持水性的關(guān)系,同時(shí)運(yùn)用肌肉組織形態(tài)學(xué)來觀察肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)變化,直觀地得出細(xì)胞間隙與持水性的關(guān)系,旨在進(jìn)一步為豬肉持水性的形成機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在云南省曲靖市東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)食品有限公司取樣,選擇飼養(yǎng)條件相同的大河烏豬。依據(jù)Warner等[14]的標(biāo)準(zhǔn)(PSE:L*>50,滴水損失DL>5%,pH<6.0;正常:L*=42～50,DL<5%,pH<6.0)確定10個(gè)正常肉樣和8個(gè)PSE肉樣。在4 ℃的條件下測(cè)定樣品滴水損失率,并于各時(shí)間點(diǎn)(1,6,24 h,2,3,5 d)分別取樣,用錫箔紙包裹后于-20 ℃凍藏保存,用于蛋白質(zhì)印跡分析(western blot)。

HC-3018R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;T25-Basc 高速勻漿機(jī) 德國(guó)艾卡公司;BioRad PowerPac 通用電泳儀電源 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;BioRad 小型垂直電泳系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;BioRad 槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司;全自動(dòng)酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 持水性的測(cè)定 參照Honikel的方法[15]測(cè)定汁液流失率(DL),修改方法如下:于宰后24 h切取背最長(zhǎng)肌,修成長(zhǎng)×寬×高為5 cm×3 cm×2 cm的肉條,用萬分之一天平稱初重W1。用鐵絲鉤住肉條的一端,保持肌纖維垂直向下,裝在聚乙烯薄膜袋中(肉樣不能和薄膜袋接觸),扎緊袋口后懸掛于鐵架車上,置于冷庫(kù)中,在4 ℃條件下吊掛48 h,取出稱重W2。DL計(jì)算如下:

1.2.2 全肌肉蛋白的提取 參照Huff-Lonergan等[16]的方法。稱取0.2g切碎的背最長(zhǎng)肌肉樣,加入25 ℃ 5mL全肌肉蛋白提取液(0.01 mol/L磷酸鈉(pH7.0),2% 十二烷基硫酸鈉(SDS)(w/v)),勻漿30 s(≤10000 r/min,)后,在20 ℃、離心力1500×g條件下離心15 min,用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉法(BCA)測(cè)定上清液濃度,然后用去離子水調(diào)蛋白濃度為6.4 mg/mL。取1 mL調(diào)整好的蛋白質(zhì)上清液與0.5 mL上樣緩沖液(0.03 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液(Tris-HCl),0.003 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),3% SDS溶液,30%甘油,1%溴酚藍(lán)1 mL,pH8.0)混合后加入0.1 mLβ-巰基乙醇。所得樣品溶液于50 ℃水浴鍋中加熱20 min,然后冷卻在-20 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 參照Huff-Lonergan等[16]的方法。電泳凝膠使用5%的濃縮膠和10%的分離膠,制膠厚度0.75 mm。從左至右依次加入預(yù)染的標(biāo)樣對(duì)照(Marker)5 μL、標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Magic mark)5 μL、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品(R10-1 h),各時(shí)間點(diǎn)蛋白樣品(integrin上樣量100 μg)。樣品通過濃縮膠時(shí)設(shè)定電壓60 V,待樣品進(jìn)入分離膠調(diào)電壓為120 V。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡(Western-Blot) 參照Huff-Lonergan等[16]的方法。電泳結(jié)束后,在-1 ℃、90 V條件下于轉(zhuǎn)印緩沖液(0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,0.002 mol/L EDTA和15%(v/v)甲醇)中轉(zhuǎn)印1.5 h。轉(zhuǎn)印后,將轉(zhuǎn)印膜放置于用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋的5%脫脂奶粉封閉液中,室溫在搖床上緩慢搖動(dòng)1h。封閉結(jié)束后取出轉(zhuǎn)印膜置于含有20mL用封閉液稀釋的一抗(Anti-Integrin β1D Antibody,C-terminus cytoplasmic domain,clone 2B1,MAB1900,Merck Millipore)中,封口,4 ℃搖床上緩慢搖動(dòng)過夜。一抗孵育過夜后,integrin在室溫下用PBST洗膜3次,每次10 min。在室溫下將洗過的膜置于20 mL用封閉液稀釋的二抗(HRP-Goat Anti-mouse conjugated horseradish peroxidase,Catalog NO.SA00001-1,proteintech)中封閉1h。integrin在室溫下用PBST洗膜3次,每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑盒(EZ-ECL PLUS Kit HRP,Catalog NO.20-500-120,Bioind)和膠片機(jī)來識(shí)別目標(biāo)蛋白表達(dá)信號(hào)。形成膠片后將轉(zhuǎn)印膜置于PBST中洗三次,每次10 min。將洗好的轉(zhuǎn)印膜置于20 mL用封閉液稀釋的β-actin(ACTB Monoclonal Antibody,抗體,Proteintech)中,封口,4 ℃搖床上緩慢搖動(dòng)過夜。β-actin孵育完成后,integrin在室溫下用PBST洗膜3次,每次10 min。在室溫下將洗過的膜置于20 mL用封閉液稀釋的二抗中孵育1 h。integrin在室溫下用PBST洗膜3次,每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑盒(EZ-ECL PLUS Kit HRP,Catalog NO.20-500-120,Bioind)和膠片沖洗機(jī)來識(shí)別目標(biāo)蛋白表達(dá)信號(hào)并用imageJ軟件分析蛋白條帶的光密度值。

1.2.5 肌肉組織形態(tài)學(xué)分析 參照Gerald[17]的方法。于宰后1、6、24 h取樣,每次橫切約0.5～1 cm3的小塊,置于10%的中性磷酸甲醛緩沖液中(pH7.2,液體的溫度同樣品的溫度相同)固定1 d。將樣品的厚度修整到0.5 cm繼續(xù)放入緩沖液中,在室溫條件下進(jìn)一步固定。將沖洗24 h后的肌肉組織樣品在酒精濃度梯度升高的情況下脫水透明,并用固體石蠟包埋。再用切片機(jī)切成4 μm的切片,用蘇木精-伊紅染色技術(shù)染色。用 Image-Pro Plus 5.1測(cè)得肌束中肌細(xì)胞外空隙面積占肌束面積的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel2007計(jì)算數(shù)值,并使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19進(jìn)行單因素方差分析及Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常與PSE肉的汁液流失率

正常肉的汁液流失率是1.70%,PSE肉宰后肉樣汁液流失率是6.86%,二者存在顯著差異(p<0.05)。正常肉汁液流失率比PSE肉汁液流失率低75.22%。

2.2 integrin的蛋白印跡結(jié)果

如圖2所示,宰后兩組肉樣的integrin隨時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生降解,PSE肉樣組integrin降解多于正常肉樣組。如圖1所示,正常組integrin的降解量與PSE組integrin的降解量之間不存在顯著差異(p>0.05);正常組在宰后1～24 h間integrin未出現(xiàn)明顯降解(p>0.05),在宰后24 h出現(xiàn)明顯降解(p<0.05);PSE組在宰后6～24 h出現(xiàn)顯著降解(p<0.05)。

圖1 正常肉樣組與PSE肉樣組在宰后各時(shí)間點(diǎn)integrin的降解Fig.1 Degradation of integrin in normal and PSE during postmortem注:同組肉樣內(nèi)含相同字母差異不顯著(p>0.05),含不同字母差異顯著(p<0.05),不表示兩組肉樣間的差異性;整聯(lián)蛋白完整度:宰后各時(shí)間點(diǎn)整聯(lián)蛋白含量。

圖2 正常肉與PSE肉integrin Western blot圖Fig.2 Western blot patterns of integrin in normal and PSE group注:M:Magic Mark;Reference sample:內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 integrin的完整度與汁液流失率的相關(guān)性

如表1所示,宰后豬肉樣品1～24 h、3～5 d的integrin的完整度與汁液流失率間無顯著相關(guān)性,宰后24 h后豬肉樣品的integrin的完整度與汁液流失率間呈負(fù)相關(guān)性,且2 d時(shí)間點(diǎn)integrin的完整度與汁液流失率間呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),說明宰后24 h后,integrin的降解會(huì)降低肌肉的持水性,這與Zhang W G.等[18]研究出在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上integrin的完整程度與汁液流失始終呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,即integrin降解越多,汁液流失越多的結(jié)論基本一致。

表1 宰后integrin的完整度與汁液流失率相關(guān)性(N=18)

注:*p<0.05;**p<0.01,表2同。

2.4 肌肉組織形態(tài)學(xué)的變化

2.4.1 肌束內(nèi)肌細(xì)胞間空間面積的變化 如圖3示,宰后兩組肉樣的肌肉細(xì)胞間隙面積都隨時(shí)間的增加而呈顯著性增加(p<0.05),且PSE組細(xì)胞間隙顯著高于正常組的細(xì)胞間隙面積(p<0.05)。其中,正常組宰后6～24 h的細(xì)胞間隙顯著性增加(p<0.05);PSE組宰后1～6 h樣品的細(xì)胞間隙面積呈顯著性增加(p<0.05)。

圖3 宰后肌肉細(xì)胞間空隙面積比率變化Fig.3 Changes of extracellular area during postmortem for 1,6 h and 24 h注:a、b表示同組內(nèi)含相同字母差異不顯著(p>0.05),含不同字母差異顯著(p<0.05);*表示不同組的同一時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著(p<0.05)。

圖4～圖6為宰后各時(shí)間點(diǎn)(1、6、24 h)正常組樣品和PSE組樣品肌肉細(xì)胞間隙面積差異性的比較，可以看出PSE組肌肉細(xì)胞間隙面積明顯大于正常組。

圖4 宰后1 h肌肉組織結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Change of muscular structure at 1 h postmortem注:左為正常組,右為PSE組,圖片為50倍放大圖。圖5、圖6同。

圖5 宰后6 h肌肉組織結(jié)構(gòu)變化Fig.5 Change of muscular structure at 6 h postmortem

圖6 宰后24 h肌肉組織結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Change of muscular structure at 24 h postmortem

2.4.2 細(xì)胞間隙面積與汁液流失率的相關(guān)性 如表2所示,宰后豬肉樣品在宰后1、6、24h的細(xì)胞間隙面積與汁液流失率呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。Lawson等[9]觀察到宰后流失通道的形成不是在結(jié)締組織和肌纖維之間分開的地方,而是在肌細(xì)胞膜和肌纖維分開的位置,認(rèn)為宰后僵直收縮過程中肌原纖維之間擠出的水分可能進(jìn)入肌原纖維和細(xì)胞膜之間的通道中,而鈣激活酶的作用導(dǎo)致整連蛋白的降解和肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮是形成該流失通道和汁液流失的決定因素。Schafer[8]等認(rèn)為細(xì)胞外間隙和汁液流失有較好的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中,宰后正常肉樣與PSE肉樣的細(xì)胞間隙面積都隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,但PSE組細(xì)胞間隙面積始終顯著大于正常組(p<0.05);宰后細(xì)胞間隙面積與汁液流失率呈極顯著正相關(guān)(p<0.05),說明細(xì)胞間隙面積越大,汁液流失率越高。

表2 宰后細(xì)胞間隙面積與汁液流失率的相關(guān)性(N=18)

2.4.3 細(xì)胞間隙面積與integrin完整度的相關(guān)性 如表3所示,宰后豬肉樣品在宰后24 h的integrin完整度與宰后1 h的細(xì)胞間間隙面積呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05);宰后2 d的integrin完整度與宰后1,24 h的細(xì)胞間間隙面積呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01);宰后3 d的integrin完整度與宰后6 h的細(xì)胞間間隙面積呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),說明integrin的降解越多,細(xì)胞間隙越大。

3 結(jié)論

宰后兩組肉樣的integrin都隨著貯藏時(shí)間的推移而降解,正常肉樣中integrin的降解小于PSE肉。宰后24 h后,integrin的完整度與汁液流失率呈負(fù)相關(guān)。宰后兩組肉樣的肌肉細(xì)胞間隙面積都隨時(shí)間的增加而顯著性增大,且PSE組細(xì)胞間隙顯著大于正常組的細(xì)胞間隙面積。宰后integrin的完整度與細(xì)胞間隙面積率呈負(fù)相關(guān)性。這說明宰后integrin的降解速度和降解程度與細(xì)胞間隙面積及肉的持水性有關(guān),它們的降解會(huì)促進(jìn)細(xì)胞間隙過早過大地形成,從而降低肉的持水性。

表3 細(xì)胞間隙面積與宰后integrin的完整度的相關(guān)性(N=18)

注:*p<0.05;**p<0.01,表中數(shù)據(jù)為同行間比較。

[1]Hamilton DN,Ellis M,Miller KD,et al. The effect of the Halothane and Rendement Napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs[J]. Journal of Animal Science,2000,78:2862-2867.

[2]Stoier S,Aaslyng MD,Olsen EV,et al. The effect of stress during lairage and stunning on muscle metabolism and drip loss in Danish pork[J]. Meat Science,2001,59:127-131.

[3]Kristensen L,Purslow PP. The effect of ageing on the water holding capacity of pork:role of cytoskeletal proteins[J]. Meat Science,2001,58:17-23.

[4]Maribo H,Olsen EV,Barton-Gade P,et al,A. Effect of early post-mortem cooling on temperature,pH fall and meat quality in pigs[J]. Meat Science,1998,50:115-129.

[5]Rowe LJ,Maddock KR,Lonergan SM,et al. Oxidative environments decrease tenderization of beef steaks through inactivation of μ-calpain[J]. Journal of Animal Science,2004,82:3254-3266.

[6]Huff-Lonergan E,Lonergan SM. Mechanism of water-holding capacity of meat:the role of postmortem biochemical and structural changes[J]. Meat Science,2005,71:194-204.

[7]Melody JL,Lonergan SM,Rowe LJ,et al. Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity of three porcine muscles[J]. Journal of Animal Science,2004,82:1195-1205.

[8]Schafer A,Rosenvold K,Purslow PP,et al. Physiological and structural events post mortem of importance for drip loss in pork[J]. Meat Science,2002,61:355-366.

[9]Lawson M A. The role of integrin degradation in post-mortem drip loss in pork[J]. Meat science,2004,68(4):559-566.

[10]Hynes R O. Integrins:versatility,modulation,and signaling in cell adhesion.[J]. Cell,1992,69(1):11.

[11]周光宏,羅欣,徐幸蓮,等. 肉品加工學(xué)[M]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009.

[12]陳韜. 宰后肌肉蛋白質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)變化與冷卻豬肉持水性的關(guān)系研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[13]Straadt IK,Rasmussen M,Young JF,et al. Any link between integrin degradation and water-holding capacity in pork[J]. Meat science,2008,80(3):722-727.

[14]Warner RD,Kaufman RG,Greaser ML. Muscle Protein Changes Post Mortem in Relation to pork Quality Traits[J]. Meat Science,1997,45(3):339-352.

[15]Karl OH. Reference Methods for the Assessment of Physical Characteristics of Meat[J].Meat Science,1998,49(4):447-457.

[16]Lonergan SM,Huff-Lonergan E,Rowe LJ,et al. Selection for lean growth efficiency in Duroc pigs influences pork quality[J]. Journal of Animal Science,2001,79:2075-2085.

[17]Offer G. Modelling of the formation of pale,soft and exudative meat:Effects of chilling regime and rate and extent of glycolysis[J]. Meat Science,1991,30:157-184.

[18]Zhang WG,Lonergan SM,Gardner MA,et al. Contribution of postmortem changes of integrin,desmin and μ-calpain to variation in water holding capacity of pork[J]. Meat Science,2006,74(3):578-585.

Study on the relationship between the changes of integrin and water holding capacity of PSE and normal pork during postmortem

WU Shuang,CHEN Tao*,ZHANG Dong-yi,LIU Shao,MA Ning

(College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The relationship between drip loss and the degradation of integrin of normal and PSE pork at post-mortem were analyzed by western blots and histological microscopic measurement techniques. The results showed that integrin both in normal and PSE(Pale,Soft,Exudative)meat were degraded gradually with the extension of time during postmortem,and there was no significant difference in the quantities of degradation between normal and PSE meat(p>0.05). The degradation of integrin of normal pork was significant at 24 h during postmortem(p<0.05). The degradation of integrin of PSE pork was significant at 6 h during postmortem(p<0.05). The integrity of integrin and drip loss was negatively correlated at 2 d during postmortem(p<0.05).The area of muscle cell gap were increased both in normal and PSE pork during postmortem. The gap area showed a significant increase at 1,6,24 h during postmortem,and the gap area of PSE pork was significantly higher than normal pork. Also the cell gap area at 1,6,24 h were positively correlated with the drip loss during postmortem(p<0.01). The experimental results showed that the less the degradation of integrin,the smaller the cell gap area and the drip loss,also stronger the muscle water holding capacity.

pork;water holding capacity;integrin;extracellular area;relevance

2014-12-09

吳霜(1989-)，男，碩士研究生，主要從事畜產(chǎn)品加工與品質(zhì)控制研究，E-mail:wushuangcn@163.com。

*通訊作者:陳韜(1963-)，男，博士，教授，主要從事肉品質(zhì)控制和畜產(chǎn)品加工研究，E-mail:chentao63@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171711)資助。

TS251

B

1002-0306(2015)21-0064-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.004