穆志新 ，田 翔 ，周建萍 ，師 穎

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，山西太原030031）

蕎麥最早起源于我國(guó)，栽培歷史悠久，種植經(jīng)驗(yàn)也很豐富。蕎麥味道清香，在日本、朝鮮、韓國(guó)以及我國(guó)的東北、華北等地區(qū)都是很受歡迎的食品[1-2]。蕎麥?zhǔn)且环N獨(dú)特的藥食兩用作物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值豐富。利用蕎米和蕎麥面粉直接加工可以制作成面條、烙餅、涼粉、灌腸等地方特色小吃。蕎麥性甘味涼，含有非常豐富的天然生物活性成分黃酮類(lèi)物質(zhì)——蘆丁。蘆丁又稱(chēng)維生素P，屬于維生素類(lèi)藥，能夠有效地降低毛細(xì)血管的通透性和脆性，從而保持和恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性；還可用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等，也可用作食品抗氧化劑和色素。此外，蘆丁還是心腦血管用藥合成曲克蘆丁的主要原料，而曲克蘆丁能有效地抑制血小板的聚集，防止血栓的形成。

蕎麥中蘆丁含量的高低影響著蕎麥的品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)研究一種檢測(cè)蕎麥中蘆丁含量的有效方法[3-4]，旨在為進(jìn)一步選育高蘆丁含量的蕎麥品種以及將其用于醫(yī)藥工業(yè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品

供試苦蕎樣品由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所蕎麥課題組育種專(zhuān)家提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技；AS10200AT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯；BSA2202S分析天平，德國(guó)賽多利斯；Eppendorf5804R高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；DirectQ-3超純水機(jī)，美國(guó)Millipole；DHG-9140AS電熱鼓風(fēng)干燥箱，寧波東南儀器有限公司。

甲醇色譜純：Fisher Scientific；標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁（純度98%）：Sigma；磷酸二氫鉀優(yōu)級(jí)純：國(guó)藥集團(tuán)；水為超純水。

1.3 色譜條件

安捷倫 C18柱（4.6mm×150 mm，5μm），柱溫為30℃，甲醇∶0.5%磷酸（V/V）＝40∶60作為流動(dòng)相，流速為1mL/min，進(jìn)樣量是5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

精密稱(chēng)取干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，加入甲醇定容至10mL，制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液[5]。再將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 50，100，200，300，400μg/mL的質(zhì)量濃度梯度。圖1為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，保留時(shí)間為3.475min[6-8]。

1.5 樣品處理

取樣10 g，置于40℃烘干箱中鼓風(fēng)干燥4 h，立即放入旋風(fēng)磨中粉碎，并全部通過(guò)0.177mm篩，備用。取制備好的試樣0.10 g于2mL離心管中，加1mL甲醇振蕩混勻，水溫60℃超聲萃取1 h，再以4 000 r/min的速度離心10 min，收集上清液，重復(fù)2次，并將2次提取液合并到25mL容量瓶中，用0.1mol/L磷酸調(diào)pH值至6左右，定容。過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜備用[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與樣品測(cè)定[11-13]

取1.4配制的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，質(zhì)量濃度按從低到高順序分別進(jìn)樣5μL，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線(xiàn)。同時(shí)取萃取好的待測(cè)樣液過(guò)濾后進(jìn)樣5μL，記錄峰面積。從工作曲線(xiàn)上查出待測(cè)各組分的質(zhì)量濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算被測(cè)樣品中各組分的百分含量。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品含量在50.0～400.0μg/mL范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系（圖2），按照標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（y）得到線(xiàn)性方程：y＝10.946x－247.2（R2＝0.999 7）。

2.2 樣品含量測(cè)定

按照1.5的方法處理蕎麥樣品，并且按照1.3的色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。根據(jù)濃度、稀釋倍數(shù)以及樣品的重復(fù)，計(jì)算得出蕎麥中的蘆丁含量。可以根據(jù)苦蕎蘆丁含量篩選出蘆丁高含量苦蕎種質(zhì)資源[14]（表1）。圖3為蕎麥樣品蘆丁含量色譜圖。

表1 24份核心種質(zhì)資源蘆丁含量

2.3 方法的精密度和回收率測(cè)定

稱(chēng)取0.1 g的蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.5mg/kg的蕎麥樣品6份，分別按照3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平50，80，100mg/kg加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本試驗(yàn)方法進(jìn)行提取和測(cè)定（每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次），計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[15]。從表2可以看出，平均加標(biāo)回收率介于97.2%～104.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于1.8%～2.3%之間，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

表2 精密度和回收率測(cè)定結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

12 h內(nèi)每隔2 h對(duì)蕎麥進(jìn)樣一次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，供試樣品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。

3 討論

之前的研究往往采用60%～70%的乙醇或甲醇提取蕎麥中的蘆丁。在本試驗(yàn)中，采用流動(dòng)相甲醇來(lái)提取蕎麥中的蘆丁，相比于用乙醇提取蘆丁，該方法提取樣品的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的重復(fù)性都更好。在用高效液相色譜法檢測(cè)蘆丁的含量時(shí)，主要是通過(guò)控制流動(dòng)相比例及檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)優(yōu)化試驗(yàn)條件[16]。近年來(lái)，隨著生活水平的不斷提高，人們?cè)絹?lái)越注重食品的功能性，即食品的保健作用，作物育種工作的熱點(diǎn)也隨之向功能育種轉(zhuǎn)變。種質(zhì)資源是育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，同樣功能育種也需要發(fā)掘特異性狀優(yōu)良的種質(zhì)。對(duì)所搜集的核心種質(zhì)進(jìn)行蘆丁含量測(cè)定，篩選出蘆丁高含量和高產(chǎn)量的蕎麥種質(zhì)，以期為蕎麥功能育種提供依據(jù)。

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