摘要：目的：為了簡化微生物法測定奶粉中強(qiáng)化葉酸的操作步驟，使該方法便于操作，同時(shí)又不影響方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。方法：利用干酪乳桿菌對食品中葉酸的特異性，測定奶粉中強(qiáng)化葉酸含量。通過改進(jìn)后的方法與國標(biāo)方法的比較，考察改進(jìn)后方法的穩(wěn)定性和可操作性。結(jié)果：改進(jìn)后的方法操作較為簡單，普通的微生物檢測人員均可勝任，同時(shí)準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性與國標(biāo)方法沒有差異。結(jié)論：可以通過方法改進(jìn)對標(biāo)準(zhǔn)中過于繁瑣的步驟進(jìn)行簡化，使方法更加方便操作，易于推廣。

關(guān)鍵詞：奶粉 強(qiáng)化葉酸 測定方法 方法改進(jìn)

中圖分類號(hào)：R155.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）04-0035-03

維生素是維持人體生命活動(dòng)必須的一類有機(jī)物質(zhì)，大多數(shù)的維生素，機(jī)體不能合成或合成量不足，不能滿足機(jī)體的需要，必須通過食物獲得。水溶性維生素，在體內(nèi)不能儲(chǔ)存，所以每日需要從食物中獲得一定的補(bǔ)充。維生素的缺乏會(huì)引起一些疾病，但維生素的攝取也不是越多越好，有研究表明，過多攝入維生素也會(huì)引起一些中毒[1]。因此，控制維生素每日攝入量尤為重要，特別是控制嬰幼兒維生素的每日攝入量。目前國內(nèi)對嬰幼兒奶粉的需求非常高，嬰幼兒奶粉中的維生素主要通過人為添加，所以準(zhǔn)確的檢測奶粉中維生素含量是保持維生素合理攝入的技術(shù)支撐。

目前維生素的測定方法包括：比色測定法、熒光測定法、薄層色譜法、高效液相色譜法、滴定分析法、蛋白質(zhì)藕合法、毛細(xì)管電泳法、EILSA法、微生物法等[2-3]。在諸多方法中微生物法獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，是其他方法無法替代的，包括測定被測組分的特異性、活性成分、靈敏度和結(jié)果準(zhǔn)確性等。目前為止，美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）以及食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（GB5413—2010）都將微生物法作為葉酸、維生素B12、生物素等檢測的首選方法和仲裁方法[4]。但微生物方法存在步驟繁瑣、操作耗時(shí)、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題[5]，需要對人員、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)方法、環(huán)境設(shè)施等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效控制[6]。本文通過對國家標(biāo)準(zhǔn)GB5413.16—2010[7]嬰幼兒食品和乳制品中強(qiáng)化葉酸含量的測定方法進(jìn)行改進(jìn)，主要用于食品中強(qiáng)化葉酸的測定，改進(jìn)后的方法與國標(biāo)法相比，具有檢測操作步驟簡化，準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性與國標(biāo)法相似。改進(jìn)后的方法從維生素提取、試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、菌株接種等多方面進(jìn)行改進(jìn)，從而使得方法操作簡便，一般實(shí)驗(yàn)員均可操作。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

來自市場上銷售的嬰幼兒配方乳粉。

1.1.2 菌種

試驗(yàn)菌株為干酪乳桿菌（Lactobacillus leichmanniii ）ATCC 7469，購置于廣東省微生物研究所。

1.1.3 材料和試劑

抗壞血酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（天津化學(xué)試劑一廠），葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（Accustandard公司），葉酸測定培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯（BD公司），MRS（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），無菌濾膜（上海津騰），無菌容量瓶，一次性注射器等。

1.1.4 儀器

AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司），日本TOMY全自動(dòng)滅菌鍋，TU-1800SPC分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），RT-6000酶標(biāo)儀（德國IFP），安泰超凈工作臺(tái)，SPX-800恒溫培養(yǎng)箱，MVS-1型漩渦混合器，百得移液槍等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

菌種制備以及國標(biāo)法具體操作參見標(biāo)準(zhǔn)GB5413.16—2010，以下只將改進(jìn)后的方法列出。

1.2.1 試劑配制

（1）無菌磷酸鹽緩沖液：5.85 g磷酸二氫鉀，1.22g磷酸氫二鉀，用1000mL水溶解。臨用前加入5g抗壞血酸鈉溶解，然后用0.2μm無菌濾膜過濾至無菌容器。

（2）無菌培養(yǎng)基制備，準(zhǔn)確稱取9.4g干粉培養(yǎng)基于200mL燒杯，加入50mg抗壞血酸，加入100mL蒸餾水溶解后，煮沸1min～2min，迅速冷卻后用0.2μm無菌濾膜過濾至無菌容器中。

（3）無菌葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：稱取55mg～56mg（精確至0.1 mg）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50mL蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入2mL的10.8%氨水，按純度稀釋至10ng/mL，用0.2μm無菌濾膜過濾至無菌容器，采用無菌操作準(zhǔn)確移取10mL于100mL無菌容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖定容，此溶液葉酸含量為1ng/mL。采用無菌操作按表1進(jìn)行制備，一式三份，S1為空白對照（直接移取5mL無菌蒸餾水和5mL無菌培養(yǎng)基），S2為參比空白，S2到S10中的培養(yǎng)基為每100mL無菌培養(yǎng)基中加入制備好的光密度為60%～80%菌液1mL的培養(yǎng)基。

1.2.2 乳粉樣品處理

精確稱取2.0g樣品（精確至0.1 mg）于三角瓶中，加入40 mL磷酸鹽緩沖液，混勻，100 ℃水浴5min，期間振蕩至少3次，迅速冷卻至室溫，用磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，然后利用0.2μm無菌濾膜過濾至10 mL無菌離心管中，以下步驟采用無菌操作。用無菌磷酸鹽緩沖液按產(chǎn)品標(biāo)示值稀釋至1ng/mL，按表2進(jìn)行操作，一式三份，葉酸測定用培養(yǎng)基（1.2.1.2）為已接種好的培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)測定

將上述的所有試管放入培養(yǎng)箱中，36℃±1℃培養(yǎng)16h～24h后，進(jìn)行光密度測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)法和改進(jìn)后方法標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

從表3和表4可以看出，國標(biāo)法和改進(jìn)后方法標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值均落在0～1之間，且OD值平均數(shù)差異不大，從表5可以看出改進(jìn)后的方法與國標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度基本重合，沒有明顯差異。綜合圖表，改進(jìn)后的方法與國標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線沒有明顯差異，可以用于結(jié)果計(jì)算。

2.2 結(jié)果與分析（表6）

利用國標(biāo)法和改進(jìn)后方法對兩個(gè)不同樣品進(jìn)行檢測，任意兩次測定結(jié)果符合國標(biāo)法兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值10%的要求。樣品1兩種方法測定的兩個(gè)平均值采用t檢驗(yàn)，t=0.206，自由度n=3-1=2， 查表，t0.05=4.303，故t

3 討論

國標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中存在的問題。國標(biāo)法中對標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，沒有說明使用什么樣公式來繪制曲線。微生物的生長遵循生長曲線是S形，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同多項(xiàng)式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合程度不同，采用四階方程擬合程度好于采用二階方程，建議統(tǒng)一采用四階方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)后的方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響。改進(jìn)后的方法只是對方法本身操作進(jìn)行改進(jìn)，并沒有改變方法的基本原理，通過與國標(biāo)方法比較發(fā)現(xiàn)，無論是標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品測定還是加標(biāo)回收都能達(dá)到國標(biāo)法要求，改進(jìn)后的方法操作起來更加方便、省時(shí)，主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：

（1）減少分解，縮短除菌時(shí)間。維生素不穩(wěn)定，容易受光和熱的影響。樣品處理過程中和培養(yǎng)基，通過過濾除菌，不但減少高壓滅菌對維生素的破壞，也減少滅菌過程所消耗的時(shí)間。采用高壓滅菌從升溫到冷卻，整個(gè)過程需要1個(gè)多小時(shí)，過濾除菌只需要十幾分鐘。

（2）減少移液管的調(diào)節(jié)次數(shù)，簡化操作。國標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品配制最后都只稀釋成一個(gè)濃度，測定時(shí)標(biāo)液和樣品加入量都必須靠調(diào)整體積來實(shí)現(xiàn)，會(huì)造成移液管體積不停的變化。該方法完成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和一個(gè)樣品的配制就需要使用超過42支試管，每支試管要加入標(biāo)液或樣液、蒸餾水和培養(yǎng)基三種，移液次數(shù)相當(dāng)多，稍不留意就可能移錯(cuò)體積。改用先對標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣液進(jìn)行系列稀釋的辦法，可以有效的減少移液管的調(diào)節(jié)次數(shù)，操作方式從每個(gè)步驟按標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)移液體積，變成稀釋后機(jī)械化移取相同體積，大大提高工作效率，減少人為因素帶來的影響。

（3）減少菌種加入次數(shù)。采用將培養(yǎng)基預(yù)留部分做空白后，其余培養(yǎng)基統(tǒng)一接種的方法，可以有效消除單管接種接種量不同。統(tǒng)一接種和每支試管單一接種相比，可以大大減少接種時(shí)間，使整個(gè)過程更加流暢快捷。

雖然對方法進(jìn)行了簡化，但還是存在一些繁瑣的地方，可以在今后工作中不斷改進(jìn)。如：分光光度計(jì)測定，一個(gè)樣品幾十個(gè)數(shù)據(jù)完成測定要2h左右。假如每次十幾個(gè)樣品，甚至更多，那將花費(fèi)大量人力物力，可以考慮參照試劑盒的方法[9]，將培養(yǎng)好的培養(yǎng)液混勻后移取相同體積于96孔板，采用酶標(biāo)儀讀數(shù)，可以大大簡化讀數(shù)過程。此外，微生物法還可以從優(yōu)化菌種、減少培養(yǎng)體系的體積等方面來對方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，使方法進(jìn)一步簡化，可操作性更強(qiáng)。

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