摘要：研究了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)鵝血液的水解作用，以水解度為指標(biāo)，用響應(yīng)面分析對(duì)其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一個(gè)水解模型，其最優(yōu)化條件是加酶量為4693.46 U/g、溫度為53.67℃、時(shí)間為3.6h、底物濃度為9.54%。達(dá)到最大水解度24.29%。

關(guān)鍵詞：酶解 血紅蛋白 鵝血 響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：TS249.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）04-0012-02

鵝是食草家禽，其血液含豐富的可利用營(yíng)養(yǎng)成分。有報(bào)道鵝血具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，對(duì)食道癌、上呼吸道癌、肝癌等具有良好的功效[1]。

近年來，科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游離氨基酸更易、更快被機(jī)體吸收利用。這是肽研究理論和實(shí)踐的重大突破[2]。酶水解血液可以制備游離氨基酸和功能肽，功能肽在促進(jìn)免疫細(xì)胞增生、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有一定的功效。

因此，本研究采用蛋白酶水解鵝血紅蛋白，對(duì)其工藝及水解條件進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步從鵝血中提取蛋白肽提供了可靠的依據(jù)。

l 材料與方法

1.1 原料與試劑

鵝血，采自吉林德萊鵝業(yè)公司的新鮮、檢疫合格的鵝血；中性蛋白酶（16.3×10‘U/g）、木瓜蛋白酶（50.6×104 U/g），均為食品級(jí)，廣西南寧龐博生物工程有限公司，甲醛、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

微量凱氏定氮裝置、精密pH計(jì)、分析天平、高速離心機(jī)、超聲波粉碎儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血紅蛋白的制備

新鮮鵝血按3.8 g/kg血量加入食用檸檬酸鈉抗凝，并充分?jǐn)嚢瑁x心分離，下層為血細(xì)胞。沉淀用生理鹽水（0.9%NaCI）洗滌血細(xì)胞，然后離心，收集沉淀的血細(xì)胞，加入1倍體積的蒸餾水，用超聲波粉碎儀處理，再離心去除細(xì)胞膜及雜質(zhì)沉淀，得到血紅蛋白溶液。

2.2 酶水解工藝

新鮮鵝血→抗凝→離心→破胞→離心→血紅蛋白原液→酶水解→滅酶終止反應(yīng)→離心→脫色→離心→水解蛋白液→提純分離→多肽

2.3 檢驗(yàn)方法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB/T5009.5-2003；

酶活性測(cè)定：參照QB/T180-93；

氨態(tài)氮測(cè)定：參照GB/T5009.39-96；

水解度DH%的測(cè)定：

DH=水解液中總游離氨基酸含氮量/總氮量

2.4 酶制劑的篩選

在相同的底物濃度的樣品溶液中，分別加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解專用酶4種酶來水解樣品。擬定各酶適宜的溫度、酶解時(shí)間、酶添加量。水解后測(cè)定各組的水解度，確定最佳用酶。

2.5 水解條件的響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以中性蛋白酶與木瓜蛋白酶1：1混合水解鵝血紅蛋白，以水解度為指標(biāo)，對(duì)加酶量（X1）、溫度（X2）、時(shí)間（X3）底物濃度（X4）、共4個(gè)主要水解反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立一個(gè)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合數(shù)學(xué)模型。各反應(yīng)變量及其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平編碼值見表l。

3 結(jié)果與分析

3.1 酶的篩選

由于酶具有特異性和選擇性。要使鵝血紅蛋白酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，選擇適宜的酶至關(guān)重要。本研究選用不同的酶在各自最適條件下水解骨蛋白。其結(jié)果見圖1。

由圖中可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解效果理想；由于雙酶水解有協(xié)同增效作用；所以選用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶以1：1的比例做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3.2 酶水解參數(shù)的優(yōu)化

以水解度為指標(biāo)的4因素響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

經(jīng)回歸擬合后各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可得到蛋白水解液提取率回歸方程為：

Y=-107.48375+0.0067*Xl+4.651583*X2+4.860417*X3-3.669375*X4-0.000001127*X1*X1-0.000030370*X2*X1- 0.056571*X2*X2+0.000389*X3*X1+0.070875*X3*X2- 1.525521*X3*X3+0.00043*X4*X1+0.137063*X4*X2+ 0.050937*X4*X3-0.308568*X4*X4

運(yùn)用RSREG程序進(jìn)行方差分析：其方差分析結(jié)果見表3。

二次回歸模型F值為18.46，P值<0.001，大于在0.01水平上的F值，而失擬項(xiàng)的F值為1.85，小于在0.05水平上的F值，說明該模型擬和結(jié)果好。

一次項(xiàng)，二次項(xiàng)的F值大于0.0l水平上的F值，說明各個(gè)因素和各因素之間作用都對(duì)提取率有極其顯著的影響。參數(shù)R2為0.9417（>0.85），F(xiàn)=18.72>F 0.00l（14，16）=3.45，說明該模型是可靠的。

將兩個(gè)因素固定在零水平，然后用水解度與兩個(gè)不同因素做等值線圖（見圖1～3）。

由SAS響應(yīng)面優(yōu)化圖，可以得出等高線圖和響應(yīng)面趨勢(shì)具有一致性。從曲線的彎曲度可以看出，各因素影響程度從大到小的依次排列為溫度、底物濃度、加酶量和時(shí)間。提取率最高時(shí)的加酶量為4693.46 U/g、溫度為53.67℃、時(shí)間為3.6h、底物濃度為9.54%。在此條件下達(dá)到最大水解度24.29%。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過加入不同蛋白酶來水解鵝血紅蛋白，確定了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)鵝血液進(jìn)行水解為最佳用酶。以水解度作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了4因素5水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，從而得到最佳水解工藝條件：加酶量為4693.46U/g、溫度為53.67℃、時(shí)間為3.6h、底物濃度為9.54%。在此條件下達(dá)到最大水解度24.29%。從而為進(jìn)一步開發(fā)禽、畜血紅蛋白產(chǎn)品提供可靠的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]湯風(fēng)霞，喬長(zhǎng)晟.豬血水解蛋白生產(chǎn)工藝的研究[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，（2）：42-49.

[2]張華山.豬血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J].氨基酸和生物資源，1999，（3）t35-37.

[3]王欽德 主編.食品實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.