韓維娜等

摘要

[目的] 通過化學(xué)方法合成一種新穎的HgDADPA柱，用于分離和富集植物及微生物體中硫硒修飾的化合物。[方法] 使用二氨基二異丙基瓊脂糖（DADPA）與對氯汞苯甲酸進行反應(yīng)，得到HgDADPA色譜柱，用不同濃度的鹽酸洗脫不同位置取代的硫或硒化合物；然后，通過HgDADPA色譜富集大腸桿菌（E.coli）的tRNA中含硫、含硒化合物，并且鑒定。同時，測試HgDADPA色譜柱分離后樣品回收率。[結(jié)果]合成的HgDADPA柱通過0.002、0.005、0.5 mol/L HCl 洗脫， 可以分離尿苷三磷酸（UTP）、2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2SeU）和4-硒代尿苷三磷酸（4SeUTP）混合物，回收率均在90%以上。HgDADPA柱從大腸桿菌K12中選擇性地富集到3個含硫修飾的核苷酸，經(jīng)ESI和HRMS鑒定為鳥嘌呤2硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鳥嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸。[結(jié)論] 合成的HgDADPA柱對含硒、含硫化合物有很好的分離效果，且可反復(fù)使用，從而為植物、微生物中含硒或硫有機化合物的富集、分離提供一個簡便的分離材料。

關(guān)鍵詞HgDADPA柱；對氯汞苯甲酸；含硫或硒修飾核苷酸；tRNA；分離

中圖分類號S-03文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）24-012-05

研究植物及微生物體內(nèi)生物大分子的結(jié)構(gòu)修飾，對單一成分的純化是一個重要且繁瑣的過程。到目前為止，在組成總核糖核酸（tRNA）中共存在107種不同結(jié)構(gòu)修飾的核苷。越來越多的化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對硫或硒修飾的tRNA及其功能感興趣，已發(fā)現(xiàn)近23種不同的硫和硒核苷修飾的tRNA。到目前為止，研究微生物體DNA與RNA的硒和硫結(jié)構(gòu)修飾大多使用同位素示蹤法，雖然靈敏度高，但是其放射性限制其在一般實驗室的應(yīng)用。因此，合成新的分離材料一直是一個熱點。已有報道表明，用交聯(lián)葡萄糖凝膠色譜從消化過的核苷酸混合物中選擇性地分離出4-和2-硫代尿嘧啶核苷。但是，目前還沒有連接到對氯汞苯甲酸的報道。硫與硒在元素周期表中屬于同一主族，因此其化學(xué)性質(zhì)相似。如果某些載體能與硫結(jié)合，那么就能將含硒化合物分離。根據(jù)這個原則，筆者合成了一種新的汞柱，設(shè)計路線 見圖1。

合成的HgDADPA色譜純化化合物是一個可逆過程。通過不同濃度的HCl洗脫，將不同位置硫或硒修飾的核苷酸選擇性地分離。該研究方法簡單，成本低，不破壞化合物的穩(wěn)定性。HgDADPA色譜的高選擇性和高回收率可推廣至天然產(chǎn)物中含硫、含硒化合物及未知化合物的富集和分離，為下一步鑒定提供樣品。

1材料與方法

1.1儀器和試劑HRMASS質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）； ZWY200D 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）。碳酸氫鈉（NaHCO3）pH 8.8，偶聯(lián)緩沖液（0.1 mol/L MES，濃度0.9%NaCl，pH 4.7），DADPA瓊脂糖購買于Thermo公司；對氯汞苯甲酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）和UTP購于Sigma公司；2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2 SeU）和4-硒代尿嘧啶核苷（4SeUTP）由實驗室提供。BaselineZEROTM DNase，RNase A，RiboShredderTM RNase Blend購買于Epicentre公司。

LB的組成：分別稱取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉，加1 L雙蒸水，定容，加熱攪拌至溶解，滅菌后，在室溫下放置，備用。

1.2HgDADPA 色譜的合成

取3 ml二氨基二異丙基瓊脂糖DADPA（16～20 μmol 氨基/ml樹脂），加入到0.5 cm × 8 cm 柱中（最后柱床高度1 cm），自由滴下，使存儲的緩沖液耗盡后，分3次加入偶合緩沖液（0.1 mol/L MES，濃度09%NaCl，pH 4.7），每次3 ml，沖洗干凈。在整個過程中，不要使樹脂床干燥；平衡樹脂，最后添加偶合緩沖液9 ml，轉(zhuǎn)移DADPA瓊脂糖至25 ml容量瓶中。取0.306 mmol對氯汞苯甲酸，溶解到6 ml二甲基甲酰胺中，混合幾分鐘，溶解后轉(zhuǎn)移到25 ml容量瓶中。另取0.774 mmol的EDC 0.3 ml，溶解到偶合緩沖液中，然后加入裝有樹脂的圓底燒瓶中，在室溫下攪拌，經(jīng)過18 h反應(yīng)，樹脂轉(zhuǎn)移到層析柱中，并且添加洗滌緩沖液（0.1 mol/L NaHCO3（pH=8.8）），洗滌至澄清，放至4 ℃保存，備用。

1.3HgDADPA色譜分離混合物

混合4UTP、UTP、2SU和2SeU，使用Hg- DADPA色譜柱分離。步驟如下：使用移液器分別取2 μl的 10 mmol/L UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D），混合，然后加入1.8 ml雙蒸水作為樣品。使用Hg DADPA色譜分離樣品，洗脫劑分別是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脫的餾分都要通過紫外全波長掃描檢測，合并相同樣品。其中，在13管、14管之間加雙蒸水10 ml，洗脫殘存的碳酸氫鈉。

A= ECL計算樣品回收率（n=3）

1.4從大腸桿菌菌株K12（MG1665）提取tRNA

添加少量的大腸桿菌于LB中，4 ℃過夜，離心（6 000 r/min）8 min，棄上清液；留下約250 μl液體；加入含1 ml蛋白酶K組織和300 ml細胞裂解液，渦旋振蕩5 min，65 ℃孵育120 min，再將樣品置于冰上15 min，添加含175 ml的MPC蛋白沉淀試劑300 ml溶解樣品，渦旋振蕩1 min，4 ℃，離心（13 000 r/min）30 min；加入500 ml異丙醇，回收上清液；顛倒離心管30～40次，4 ℃離心20 min，小心倒出異丙醇；用濃度70%乙醇漂洗2次，不要接觸沉淀；離心，用移液管取出所有殘留的乙醇，得到總DNA和總RNA；加入6 ml不含RNA酶的游離水后，再加入Baseline ZEROTM DNase 200 μl（10×緩沖液，0.69 ml），37 ℃過夜；加入0.77 ml 3 mol/L NaCl，然后加入8 ml異丙醇，顛倒離心管30～40次；4 ℃，離心（3 000 r/min）30 min，得到tRNA。重復(fù)1次。

1.5tRNA的消化和含硫核苷酸化合物的富集

將tRNA重新溶于3 ml雙蒸水中，加入0.5 ml 5 μg/μl的RNA酶A，混勻，并在37 ℃過夜孵育。然后，經(jīng)HgDADPA色譜柱分離含硫或硒的核苷酸，洗脫劑分別是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脫的餾分都要通過紫外全波長掃描檢測，合并相同樣品。

1.6含硫核苷酸化合物的鑒定

水解tRNA后，經(jīng)過HgDADPA 色譜富集含硫、含硒核苷酸化合物，得到樣品A和B，將樣品經(jīng)HPLC分析。HPLC條件如下：PRP1反相柱，流速1 ml/min， 柱溫25 ℃， 流動相A為10 mmol/L TEAAc （pH 7.1），流動相B為含濃度60% CH3CN的10 mmol/L TEAAc （pH 7.1）。梯度洗脫，0～15 min 100% B， 16～20 min 100% A到30% B，檢測波長260、326 nm。對HPLC的每個組分進行ESI （）MS和HRMS鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1合成DADPAHg柱對混合物的分離和回收率測定

混合的UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D）有不同的最大紫外吸收峰，分別為260、300、307、365 nm。柱層析洗脫次序見圖2。重復(fù)3次，使用計算公式：A=ECL，計算樣品回收率，式中A代表吸光度；E代表吸光系數(shù)；C代表濃度；L代表比色皿厚度。UTP、2SU、2SeU、4SeUTP的回收率分別約73%、87%、90%、85%（n= 3）。HgDADPA色譜柱能夠高效地通過不同濃度的HCl洗脫劑分離不同含硫或硒的化合物，且可重復(fù)使用。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.2樣品穩(wěn)定性

由表1可知，室溫放置4 d后，2-硒代尿嘧啶核苷比4-硒代尿嘧啶核苷穩(wěn)定，在酸性條件下4-硒代尿嘧啶核苷幾乎100%降解；硒取代的化合物在中性和堿性條件下比酸性條件下要穩(wěn)定，其中在中性條件下化合物幾乎沒有發(fā)生降解，pH越低，化合物的穩(wěn)定性越差。2-硒代胸腺嘧啶核苷和4-硒代胸腺嘧啶核苷具有同樣的試驗結(jié)果，即2位比4位穩(wěn)定，在酸性條件下化合物具有不穩(wěn)定性。

2.3未消化前提取大腸桿菌得到tRNA的總量和純度從1 L大腸桿菌中提取得到9 ml的RNA，取2 μl稀釋到800 μl水中，得到紫外圖譜，計算A260/A280=1.96，表明RNA純度達到90%以上。

2.4 tRNA的消化和含硫、含硒核苷酸化合物的富集

0.1 mol/L鹽酸洗脫液在326 nm處有吸收（11～13管，樣品A），0.5 mol/L鹽酸洗脫液在326和260 nm處均有吸收（樣品B），通過紫外檢測，大致能夠判斷水解程度，A260/A326為4～10（樣品B），判斷RNA沒有徹底水解，每個修飾上面大概平均

連接有4～6個未被修飾的堿基。由圖3可知，所有餾分均

顯示在256 nm處有吸收。這可能由于是核苷酸降解后產(chǎn)生

不完全水解。然而，11～13管均在326 nm處有強吸收，故此

合并作為樣品A，將進一步分析326 nm峰的組成。

2.5樣品A的鑒定與分離

2.5.1樣品A的鑒定。

首先，以B2H6為還原劑，加入后發(fā)現(xiàn)沒有造成任何紫外吸收峰的改變（圖4）。但是，樣品A對pH敏感，尤其是在堿性條件下。樣品吸收峰在酸性條件下轉(zhuǎn)變非常緩慢，而在堿性條件下pH改變吸收峰也迅速發(fā)生改變。根據(jù)吸收峰的數(shù)值，這些變化可能是硫取代的核苷（硫尿嘧啶核苷）造成的。因此，據(jù)預(yù)測，樣品A主要是寡核苷酸，且含有硫尿嘧啶的結(jié)構(gòu)。

2.5.2樣品A的分離。

樣品A經(jīng)過高效液相分析，收集到6個不同的組分，前5個無色，第6個黃色（圖5）。

2.5.3化合物鑒定。

對HPLC的每個組分進行ESI （-）MS and HRMS鑒定。通過ESI（-）MS（圖6），分析所有的組分。684 m/z （M+-1）存在于后3個組分中，而668 m/z （M+-1）在6個組分中都存在，742 m/z （M+-1） 存在于后3個組分中。水解RNA的酶核糖核酸酶A（RNA酶A）是一個內(nèi)源性的殘留3′端嘧啶，最終形成3′-嘧啶-3′-磷酸寡居核苷酸，因此根據(jù)紫外吸收峰和HRMS，這2個峰分別對應(yīng)到鳥嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鳥嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸（表2、圖7）。

3討論

使用二氨基二異丙基瓊脂糖（DADPA）與對氯汞苯甲酸進行反應(yīng)，得到HgDADPA色譜。用不同濃度的鹽酸洗脫不同位置取代的硫或硒修飾化合物。這個反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)。當(dāng)增加HCl用量時，被HgDADPA色譜反應(yīng)結(jié)合的產(chǎn)物會被游離出來，從而被洗脫，而當(dāng)更換成其他酸時，不能達到洗脫和分離。HgDADPA色譜對酸是穩(wěn)定的，因此HgDADPA色譜的再生可以使用0.5 mol/L HCl洗脫除雜，從而活化。HgDADPA還具有一些優(yōu)點，如可重用性和高可靠性、高回收率。試驗結(jié)果顯示，最低的回收率達80%以上。該研究材料將幫助含硫和含硒修飾的內(nèi)源性大分子的富集，從而有助于進一步確定生物大分子的修飾位置。

使用合成的汞柱對來自大腸桿菌K12的tRNA中的含硫、含硒化合物分離，通過HRMS鑒定得到鳥嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鳥嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸3個化合物。消化時使用RNA酶A，存在如下原因：核糖核酸酶A是一個內(nèi)源性的核糖核酸酶，將最終水解得到3′-嘧啶-3′-磷酸根。分離、富集后在326 nm處的吸收峰是類似合成的4-硫尿嘧啶核苷酸（峰值在330 nm處）。根據(jù)這一特點，進一步通過ESIMS和HRMS確定大腸桿菌核苷酸的RNA的G4硫代尿嘧啶核苷酸、A3硫代尿嘧啶核苷酸及G5甲酰4硫代尿嘧啶核苷酸。然而，沒有發(fā)現(xiàn)硒修飾核苷酸?？赡艿脑蚴且阎淖匀话l(fā)生的硫和硒核苷在所有類型的RNA修飾中非常低，因此下一步將擴大培養(yǎng)。

總之，已合成新的HgDADPA色譜，可用于分離硫和硒修飾的RNA。這是一個經(jīng)濟和安全的純化方法，具有重復(fù)性和選擇性。2005年，上海交通大學(xué)的科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)一種新的DNA修飾，即DNA修飾中含有硫。這在核酸的研究上屬于里程碑的科學(xué)文件。這表明含有硒的DNA或RNA的修飾也可能存在于其他生物體中，或存在于更特殊的自然條件下生存的生物（如隕石坑的植物和微生物）。合成汞柱將有助于富集含硫含硒DNA或RNA修飾，使得檢測簡化，同時避免同位素對人體的傷害。今后，將使用這種新合成的HgDADPA色譜從天然植物中富集硫和硒衍生物。

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