李孟嬌

[摘 ?要]外泌體，細(xì)胞間物質(zhì)信息的傳遞者，在細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中，扮演著越來(lái)越重要的角色。然而目前對(duì)于外泌體的分離鑒定還存在一定的困難，因此本文對(duì)外泌體的分離鑒定方法進(jìn)行綜述，為外泌體的進(jìn)一步研究提供更有效的方法。

[關(guān)鍵詞]外泌體;分離;鑒定;差速離心法

中圖分類號(hào)：TU755 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）24-0193-01

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明外泌體對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)研究方面具有重要的價(jià)值，而由于外泌體的體積結(jié)構(gòu)方面的因素，其分離純化還存在很大的困難，目前比較常用的分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。

1.差速離心法

陳紹倩[1]等人以白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為材料，采用多步離心的方法成功地提取到了的外泌體。此種實(shí)驗(yàn)方法操作不是很復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單，擁有超速離心機(jī)和細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備即可，是一種比較簡(jiǎn)便的提取外泌體的方法，基本可以滿足實(shí)驗(yàn)研究的要求。但分離純度不是很高，并且經(jīng)過(guò)多次離心對(duì)外泌體的理化性質(zhì)造成一定的影響。

2.密度梯度離心法

像所有的脂質(zhì)小囊泡一樣， 外泌體懸浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范圍從 1.13g/ml到1.210g/ml，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于蔗糖介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離，從而將外泌體從混雜的物質(zhì)如蛋白聚集物或細(xì)胞凋亡的核小體碎片等中分離出來(lái)[2]。崔焱[3]等人根據(jù)其這一特性，從大量培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上清中分離純化外泌體，并對(duì)此進(jìn)行了電鏡鑒定;在得到大量較高純度的外泌體的基礎(chǔ)上，將其加入含有白細(xì)胞介素-2（1L-2）的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀察其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。

3.超濾離心法

王偉[4]等人以樹(shù)突狀細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，基于對(duì)外泌體物理特性，大小以及密度的了解，將超濾離心分離外泌體的方法與傳統(tǒng)的分級(jí)離心法進(jìn)行了比較，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明超濾離心法耗時(shí)少，產(chǎn)量和純度都得到了很大程度的提高，是一種比較高效的制備外泌體的方法。

4.免疫磁珠法

將具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗體，細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠結(jié)合而不能在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。Richard Wubbolts[5]等人在對(duì)外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和生化分析的過(guò)程中，將外泌體的標(biāo)志性蛋白—抗MHCII抗體包被于磁珠表面，通過(guò)抗原抗體特異性識(shí)別的特性有效的將外泌體分離出來(lái)。

無(wú)論采用哪種方法進(jìn)行分離，如果想對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究都必須首先確定分離得到的產(chǎn)物是不是外泌體，其次要鑒定外泌體是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)所要求的純度和數(shù)量。因此，外泌體的鑒定是必不可少的。目前，常用的鑒定方法主要有電子顯微鏡觀察、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)等。

其中電子顯微鏡觀察法是從形態(tài)和大小上對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定，但由于電鏡拍攝視野有限，因此這種方法只能對(duì)個(gè)別外泌體進(jìn)行觀察。而動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)則是從整體上對(duì)外泌體大小的分布情況進(jìn)行檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于多分散的復(fù)雜外泌體樣本的測(cè)量還存在一定的問(wèn)題。Western blot則是通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)外泌體中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，從蛋白質(zhì)組學(xué)方面對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒跟蹤分析技術(shù)逐漸成為外泌體鑒定的新技術(shù)，不但可以實(shí)時(shí)對(duì)外泌體進(jìn)行觀測(cè)，同時(shí)還可以對(duì)每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，從而計(jì)算出外泌體半徑和濃度。

外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)信息的傳遞者，在細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中，扮演著越來(lái)越重要的角色。因此，提高外泌體的分離純度，改進(jìn)外泌體的分離方法尤為重要。目前，雖然外泌體的分離與鑒定已經(jīng)擁有系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，但實(shí)際操作起來(lái)依然存在很多困難，無(wú)論是哪種方法，都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此只有將各個(gè)方法有效的結(jié)合起來(lái)，例如差速離心法與免疫磁珠法、電鏡法與Western blot結(jié)合使用，才能達(dá)到更好的分離鑒定效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳紹倩，杜英，王 鑫，顧巧麗，黃玉敏，董子明.多步離心法提取K526細(xì)胞外泌體.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） ，2006，41（3）.

[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.

[3] 崔焱，于津浦，李慧，楊莉莉，魏楓，安秀梅，任秀寶.腫瘤細(xì)胞來(lái)源胞外體的分離鑒定與功能檢測(cè).天津醫(yī)藥，2009，37（12）.

[4] 王偉，連建奇，王平忠，潘蕾，姬新穎，白雪帆，賈戰(zhàn)生.樹(shù)突狀細(xì)胞胞外體（Exosome）的超濾離心法提取及形態(tài)觀察.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23（12）.

[5] Wubbolts R1，Leckie RS，Veenhuizen PT，Schwarzmann G，M？bius W，Hoernschemeyer J，et al.Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation.J Biol Chem，2003，278（13）：10963-72.