謝 淵，趙 艷，劉正美，官志忠，周建獎

(貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Trizol(美國Invitrogen 公司)，Oligo dT18 及dNTPs(大連寶生物工程有限公司)，SYBR Green Mix(美國ABI 公司)，MMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑(美國Promega 公司)，SYBR Green QPCR Master Mix(美國ABI 公司)，Step-one plus 型實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)。GAS、CCK-BR 及內(nèi)參次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferas1，HPRT1)引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2 胃組織

收集2013 年1 月～2014 年12 月行胃鏡檢查并經(jīng)病理確診為胃癌及癌前病變的胃組織標本共51 例，所有標本均得到患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會批準。其中23 例慢性萎縮性胃炎組織、12例腸上皮化生組織、4 例非典型增生組織及12 例胃癌組織，所取胃組織患者男性23 例，女性25 例，年齡30 ～89 歲。組織標本采集后分別加入1 mL RNA 保護液，－85 ℃保存待用。

1.3 GAS、CCK-BR mRNA 表達

運用標準Trizol-酚－氯仿一步法提取各胃組織總RNA，用RNA 純化柱純化RNA，紫外分光光度法測定RNA 含量，A260/A280 鑒定RNA 純度。取2 000 ng 總RNA 加入10 μmol/L Oligo(dT)181 μL，混勻后65 ℃水浴5 min，加入10 μmol/L dNTPs 2.5 μL、5×緩沖液5 μL、200 U/μL MMV 1 μL、40 U/μL RNA 酶抑制劑0.5 μL、DEPC 水補足體積至25 μL，42 ℃60 min，95 ℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20 ℃保存?zhèn)溆?。以各組胃組織cDNA為模版，在ABI Step-one plus 型實時熒光定量PCR儀上檢測GAS、CCK-BR 和內(nèi)參HPRT1 基因的表達，反應條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，40 個循環(huán)。將各目的基因的熒光信號進行收集、分析，以胃癌組織為標準，計算各目的基因相對表達量2－ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因－CtHPRT1)處理組－(Ct目的基因－CtHPRT1)標準，用融解曲線監(jiān)測各樣本PCR 反應的特異性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RNA 的純度

提取的胃組織RNA A260/A280值為1.8 ～2.0，濃度為400 ～800 g/L，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA 中的28s rRNA、18s rRNA 清晰可見，表明提取的RNA 質(zhì)量較好，見圖1。

圖1 胃組織提取的RNA 電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RNA extracted from gastric tissues

2.2 GAS 和CCK-BR 基因擴增的特異性監(jiān)測

通過實時熒光定量PCR 熔解曲線分析目的基因GAS、CCK-BR 和內(nèi)參基因HPRT1 擴增特異性，結(jié)果3 個基因的熔解曲線均為特異性單峰，無引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)物，表明擴增的特異性好，見圖2。

圖2 目的基因熒光定量PCR 擴增熔解曲線Fig.2 Gene fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve diagram

2.3 GAS 和CCK-BR mRNA 表達水平

GAS 及其受體CCK-BR 在各類患者胃組織中均有表達，在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生患者胃組織中，GAS 和CCK-BR 的表達均高于胃癌患者(P ＜0.05)，GAS 為胃癌組患者的2.37、1.67 及1.9 倍，CCK-BR 為胃癌組患者的1.62、3.66、1.33 倍。見表2 和表3。

表2 胃癌及癌前病變胃組織中GAS mRNA 的表達Tab.2 Expression of the gastrin mRNA in gastric cancer and precancerous tissue

表3 胃癌及癌前病變胃組織CCK-BR mRNA 的表達Tab.3 Expression of the CCK-BR mRNA in gastric cancer and precancerous tissue

3 討論

胃癌是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別占全部腫瘤的第5 位和第3位［4］。研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞能自分泌GAS，作為生長因子與癌細胞上CCK-BR 結(jié)合，形成自分泌環(huán)，刺激細胞生長，在胃癌的發(fā)病機制及進程中起重要作用［5］。

本次研究發(fā)現(xiàn)GAS 及其受體CCK-BR 在胃癌和癌前病變組織中都有表達，進一步證實了胃癌細胞能自分泌GAS，作為生長因子與癌細胞上CCKBR 結(jié)合，形成自分泌環(huán)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS 在慢性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生組的表達均高于胃癌組，分別為胃癌組的2.37、1.67、1.9 倍，與唐卓斌［6］，王麗等［7］研究結(jié)果較為一致。GAS 主要由胃竇G 細胞分泌產(chǎn)生，在胃癌組的表達低于癌前病變組，可能與癌組織G細胞數(shù)目減少有關。劉錦濤等［8］通過實驗發(fā)現(xiàn)淺表性胃炎時G 細胞無明顯變化，萎縮性胃炎G 細胞密度明顯減低，嚴重萎縮的胃黏膜G 細胞消失，腸化組織中G 細胞甚少或缺如，胃竇癌組織中無G 細胞。Winslow JL［9］認為G 細胞計數(shù)是反映慢性萎縮性胃炎，特別是腸化嚴重程度的一項可靠指標，降低到正常值1/3 時，可能是演變?yōu)槲赴┑呐R界點。本研究結(jié)果中GAS 的表達變化沒有隨病程變化而遞減，分析可能是此次實驗中所收集到非典型增生組織標本過少，造成統(tǒng)計上有一定偏移的原因。

近年來發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤細胞膜上亦表達CCKBR，在體和離體實驗表明，GAS 對CCK-BR 陽性的胃癌細胞株具有刺激生長的作用，停用GAS 后這種促增殖作用消失，而應用CCK-BR 拮抗劑能抑制細胞的增殖，說明這種增殖作用是通過CCK-BR 而發(fā)揮作用的［10］。還有很多學者研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃癌組織中CCK-BR 的含量明顯高于對照正常組織，CCK-BR 廣泛參與胃癌發(fā)生發(fā)展［11－12］。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性胃炎、腸上皮化生、非典型性增生組CCK-BR 表達均高于胃癌組，分別為胃癌組的1.62、3.66、1.33 倍。分析發(fā)現(xiàn)CCK-BR 表達并未隨著胃癌病程的發(fā)展逐漸降低，未見一致性，但與GAS 的表達卻有一定的一致性。因此認為CCK-BR表達與胃癌的關系是可能是通過介導胃泌索促進腫瘤細胞的生長刺激作用而實現(xiàn)，與CCK-BR 受體本身的表達量相關性不大。

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