李文揚(yáng)，于 娜，孫宜田，康 健

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸疾病研究所，遼寧 沈陽 110001)

慢性組塞性肺疾病(COPD)是一種慢性進(jìn)展惡化的炎癥性疾病，多種原因可引起COPD 的急性加重。目前黏液纖毛清除(MCC)功能在COPD 發(fā)病中的作用日益引起人們的重視［1］。MCC 功能障礙和氣道炎癥，使細(xì)菌容易在下呼吸道定植，細(xì)菌負(fù)荷達(dá)到某一閾值水平，可引起COPD 急性發(fā)作，是使病情惡化的主要原因之一［2］。有報導(dǎo)桉檸蒎有促進(jìn)MCC 功能，增快粘液移動速度，從而稀化黏液的作用［3］。為證實桉檸蒎是否改善COPD 大鼠肺功能并提高細(xì)菌清除能力，以及其在細(xì)菌清除中所起到的作用，本研究應(yīng)用煙熏大鼠模擬COPD 模型觀察桉檸蒎對MCC 功能與細(xì)菌定植的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

桉檸蒎(九龍公司)，過濾嘴香煙(大前門，上海)，Thermo 超凈工作臺，自制煙熏箱，離心機(jī)，小動物肺功能議AniRes1030，流感嗜血桿菌，培養(yǎng)皿。

1.2 模型構(gòu)建及分組

SPF 級雄性Wister 大鼠120 只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，鼠齡12 周，體重(200±20)g，隨機(jī)分為對照組、模型組、預(yù)防組和治療組，每組30 只。分籠飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)呼吸實驗室，室溫18 ～20 ℃，濕度50%的潔凈環(huán)境，12 h 交替采光，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。模型組、預(yù)防組及治療組給予煙熏飼養(yǎng)12 周，一次熏煙燃燒大前門牌香煙40 支，每支香煙約產(chǎn)生煙霧2 L，煙霧濃度8%～10%，持續(xù)0.5 h，每日吸煙2 次，上下午各一次，每周5 d，連續(xù)12 周。預(yù)防組從實驗之日起，上午吸煙前30 min 給予桉檸蒎300 mg/kg 灌胃，不吸煙日不給藥;治療組從實驗第9 周起給予桉檸蒎，給藥方法同預(yù)防組。對照組和模型組與預(yù)防組同時間給純凈水1.5 mL 灌胃，不吸煙日不給藥。

1.3 方法

1.3.1 病理標(biāo)本的制作 取右肺中葉，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色。進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 肺功能測定 造模12 周后，各組隨即取6只大鼠，腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺上，縱行切開頸部皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織暴露氣管，在環(huán)狀軟骨下兩個氣管環(huán)處切一倒“T”型切口，行氣管插管并固定。然后在大鼠左側(cè)胸部作一切口，將與小動物肺功能儀壓力傳感器相連的胸腔管通過肋間隙插入胸膜腔，采用Medlab 醫(yī)學(xué)軟件分析系統(tǒng)測定潮氣量、氣道流速、跨肺壓，換算成氣道阻力和肺順應(yīng)性。測定呼氣峰流速(PEF)、用力呼氣容積50%肺活量的瞬間流量(FEF50%)、第0.3秒呼氣容積(FEV0.3)、第0.3 秒用力呼氣容積與用力肺活量百分比(FEV0.3/FVC)、功能殘氣量(FRC)等指標(biāo)，證實通氣功能下降并以阻塞性氣流受限為主。

1.3.3 細(xì)菌負(fù)荷的測定 在第12 周結(jié)束后麻醉大鼠，通過注射器針頭滴入氣管內(nèi)1.5×107cfu/0.1 mL 的流感嗜血桿菌(Hi)混懸液，分別于接種3、6、12 及24 h 后分批處死大鼠，每批處死6 只，行左肺肺泡灌洗。10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，股動脈放血處死動物。無菌操作下頸部正中切開皮膚，剪開肌肉后暴露氣管，眼科剪尖端向心與頸部平面呈30°角剪一小口，直徑1.5 mm 朔料軟管行氣管插管進(jìn)入2 cm，雙重棉線結(jié)扎固定。沿胸骨打開胸腔，暴露心臟，夾閉右主支氣管，注射器吸取生理鹽水與氣管插管相連，用4 ℃冷藏的生理鹽水灌洗左肺2 次，30 ～60 s 內(nèi)緩注4 mL，在肺內(nèi)停留30 s，每次反復(fù)推抽兩次，收集灌洗液，回收率達(dá)90%，雙層紗布過濾去除粘液等物，留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)。4 ℃1 000 r/min 離心10 min。完整取出全肺制成肺組織勻漿。將BALF沉渣和倍比稀釋后的肺組織勻漿分別接種于巧克力培養(yǎng)基上，5%CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)24 h［4－5］，計數(shù)BALF 和肺組織勻漿的細(xì)菌菌落。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較用t 檢驗，多組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。變量間相關(guān)性用多元線性回歸分析，P ＜0.05有相關(guān)性，r 越接近1，相關(guān)性越顯著。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變

光鏡下可見對照組肺泡壁完整，沒有明顯的炎細(xì)胞浸潤，而模型組有一定量淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤并伴有肺泡壁破裂、肺泡融合，肺泡腔增大。預(yù)防組和治療組大鼠前述病理改變較模型組均有不同程度的減輕，浸潤的炎細(xì)胞減少，肺泡腔擴(kuò)大減輕。

2.2 肺功能測定

模型組大鼠FEV0.3/FVC ＜70%，且FRC 較對照組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，功能學(xué)上達(dá)到氣流阻塞的程度。預(yù)防組和治療組的FRC 明顯低于模型組，預(yù)防組改善更為顯著，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，PEF、FEF50%、FEV0.3、FEV0.3/FVC 各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的肺功能比較(，n=6)Tab.1 Comparison of pulmonary function of rats in each group

表1 各組大鼠的肺功能比較(，n=6)Tab.1 Comparison of pulmonary function of rats in each group

(1)與對照組比較，P ＜0.01;(2)與模型組比較，P ＜0.01;(3)與對照組比較，P ＜0.05;(4)與模型組比較，P ＜0.05

組別 FRC(mL) FEV0.3/FVC(%) FEV0.3(mL/s) PEF(L/s) FEF50%(L/s)對照組 129.6±10.5 76.4±5.1 6.7±0.3 30.3±0.5 25.9±0.6模型組 200.1±42.0(1) 65.6±5.9(1) 6.3±0.7 29.0±1.8 24.0±2.3預(yù)防組 144.4±8.3(2) 68.8±6.6(3) 6.5±0.1 30.2±1.7 24.0±0.7治療組 170.5±14.6(1)(4) 68.6±7.2(3)6.6±0.2 29.8±0.4 24.8±1.2

2.3 細(xì)菌負(fù)荷

模型組的BALF 和肺組織勻漿的菌落計數(shù)在各時間點均明顯高于對照組(P ＜0.01)。除對照組BALF 菌落計數(shù)呈直線下降及模型組肺勻漿菌落計數(shù)于12 h 后再次升高呈波動型外，各組菌落計數(shù)均于種菌后第6 h 達(dá)到高峰，之后下降。于3、12 及24 h 時，預(yù)防組和治療組的肺勻漿菌落計數(shù)較模型組明顯降低，且預(yù)防組下降更為顯著，特別是24 h 時，預(yù)防組明顯低于治療組(P ＜0.01)，基本接近正常組;但在6 h 時，模型組、預(yù)防組及治療組3 組肺勻漿細(xì)菌菌落計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。于3 h、12 h，預(yù)防組和治療組的BALF 菌落計數(shù)較模型組明顯降低，且預(yù)防組下降更為顯著(P ＜0.01);在12 h 時，預(yù)防組的BALF 菌落計數(shù)明顯低于模型組及治療組(P ＜0.05);在24 h，預(yù)防組基本接近正常組。見表2、表3。

2.4 大鼠肺勻漿細(xì)菌負(fù)荷與肺功能的相關(guān)性

各組大鼠種菌后3、12 及24 h 時的肺勻漿菌落計數(shù)與FRC 呈顯著正相關(guān)(P ＜0.01)，r 分別為0.55、0.715、0.742;6 h 的 肺 勻 漿 菌 落 計 數(shù) 與FEV0.3/FVC 呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.05)，r 為－0.367;而FEV0.3與細(xì)菌負(fù)荷無相關(guān)性(P ＞0.05)。見表4。

表2 各組大鼠不同時間點的肺勻漿細(xì)菌菌落計數(shù)(105cfu，n=6)Tab.2 Bacterial colony count of lung homogenate of rats in each group at different time points

表3 各組大鼠不同時間點的BAIF 細(xì)菌菌落計數(shù)(105cfu，n=6)Tab.3 Bacterial colony count of BAlF of rats in each group at different time points

表4 肺功能對大鼠肺勻漿細(xì)菌計數(shù)多元線性回歸分析Tab.4 Multivariate linear regression analysis on pulmonary function and bacterial colony count of lung homogenate of rats

3 討論

細(xì)菌感染是引起COPD 急性發(fā)作的一個重要原因，MCC 功能在呼吸道防御機(jī)制中起著主要作用，它主要通過纖毛擺動，對黏液的清除，從而把吸附在黏液中的細(xì)菌等微生物排出體外，減低氣道的細(xì)菌負(fù)荷。因此，在正常情況下，下呼吸道始終保持無菌狀態(tài)。COPD 患者在吸煙或其他有害因素作用下，MCC 功能減低，分泌物便在氣道中積聚，使細(xì)菌容易在下呼吸道定植。細(xì)菌及其產(chǎn)物通過增強(qiáng)黏液分泌，直接或間接損害纖毛運(yùn)動，導(dǎo)致MCC 功能進(jìn)一步下降，并能持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致進(jìn)行性氣道破壞，形成惡性循環(huán)，加重COPD 進(jìn)展［2］。隨著黏液活性藥物桉檸蒎在COPD中的臨床應(yīng)用增加，對其認(rèn)識愈加深入。按檸蒎主要成分為桉油精、檸檬烯及α－蒎烯，有研究報導(dǎo)這3 種成分均有祛痰、抗菌作用［3，6］;其主要成分桉油精為桃金娘科桉屬植物的主要提取物，因具有促進(jìn)MCC 功能，增加黏液移動速度，稀化黏液。

吸煙誘導(dǎo)的COPD 大鼠模型病理學(xué)上能出現(xiàn)肺氣腫和炎細(xì)胞浸潤改變，功能學(xué)上肺功能也能達(dá)到COPD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用Wistar 大鼠被動吸煙12 周，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)了肺氣腫改變和淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤［7－8］，。小動物肺功能儀測定FEV0.3/FVC ＜70%，病理學(xué)和功能上符合COPD 大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)。肺功能檢測結(jié)果顯示桉檸蒎能降低功能殘氣量，且預(yù)防給藥組改善更為顯著，可基本接近正常組水平，但其余各項指標(biāo)均無明顯改善，提示桉檸蒎在一定程度上能夠減少COPD 大鼠肺泡死腔，改善肺泡過度充氣，但短期內(nèi)應(yīng)用不能延緩肺功能的下降趨勢或改善肺功能。

COPD 穩(wěn)定期和急性發(fā)作期下呼吸道均可分離出病原菌［9－10］。宿主的炎癥反應(yīng)與氣道細(xì)菌負(fù)荷量的增加成正比，當(dāng)細(xì)菌負(fù)荷達(dá)到某一閾值，便可引起COPD 急性加重［11］，其中流感嗜血桿菌感染占第一位。本研究以流感嗜血桿菌為例，將各組大鼠氣道內(nèi)接種該菌，在不同時間點計數(shù)不同組別大鼠氣道內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷并進(jìn)行統(tǒng)計分析;結(jié)果表明，氣道內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷在同一時間點各組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義，模型組較對照組明顯升高，桉檸蒎預(yù)防組和治療組較模型組明顯降低，其中預(yù)防組降低更加顯著;各組菌落計數(shù)均于種菌后6 h 達(dá)到高峰，之后下降，預(yù)防組于24 h 基本接近正常組，且明顯低于治療組;提示桉檸蒎在減低COPD 大鼠下呼吸道細(xì)菌負(fù)荷有一定的作用，同時表明預(yù)防用藥好于治療用藥。MCC 是氣道的非特異免疫功能，在早期即可發(fā)揮作用，本研究通過選取不同時間點計數(shù)細(xì)菌負(fù)荷，證明種菌后6 ～12 h，MCC 能發(fā)揮最大效應(yīng)。模型組大鼠肺勻漿的菌落計數(shù)于12 ～24 h有所回升，究其原因可能是由于MCC 功能障礙，不能及時清除細(xì)菌而在此時間段出現(xiàn)細(xì)菌生長與繁殖大于清除。而細(xì)菌負(fù)荷的加重亦會導(dǎo)致氣道表面Muc5b 生成量的減少，進(jìn)而引起MCC 功能的進(jìn)一步損傷［11－13］。

本研究還通過多元線性回歸分析細(xì)菌負(fù)荷與肺功能的相關(guān)性，結(jié)果顯示氣道細(xì)菌負(fù)荷與FRC呈顯著正相關(guān)，且越到排菌后期相關(guān)性越強(qiáng)，與FEV0.3/FVC 呈弱負(fù)相關(guān)，進(jìn)而得出氣道細(xì)菌負(fù)荷受肺功能的影響，肺功能(尤其是FRC 與FEV0.3/FVC)越差，MCC 功能損傷越大，細(xì)菌負(fù)荷越重。提示改善肺功能有利于恢復(fù)MCC 功能，增強(qiáng)氣道內(nèi)細(xì)菌清除，減少COPD 急性發(fā)作。

總之，本研究首次證實了作為黏液促排新藥和黏液纖毛清除系統(tǒng)恢復(fù)劑的桉檸蒎可以減少吸煙誘導(dǎo)大鼠的肺功能殘氣量，并減低其氣道流感嗜血桿菌細(xì)菌負(fù)荷。結(jié)果表明桉檸蒎對COPD 有效可能是通過對細(xì)菌的清除增加即降低細(xì)菌負(fù)荷起作用的，提高呼吸道黏液清除效率，全面恢復(fù)氣道的宿主防御功能，打破炎癥的惡性循環(huán)，有效加速呼吸系統(tǒng)炎性反應(yīng)的臨床恢復(fù)，降低氣道的易感性，減少感染復(fù)發(fā)，減少呼吸道感染時抗生素治療用藥周期，全面改善COPD 患者的生活質(zhì)量［14］。目前已有報道證實其亦有一定的抗炎作用，呂小琴等［15］研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)桉油(桃金娘科植物提取物)對脂多糖引起的大鼠慢性支氣管炎具有一定的抗炎作用，并能抑制其氣道黏蛋白高分泌現(xiàn)象。因此，桉檸蒎改善MCC 功能并減少細(xì)菌定植的藥理作用及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。隨著COPD 發(fā)病機(jī)制研究的深入，桉檸蒎的長期應(yīng)用可能延緩該病的進(jìn)展，并有可能成為針對病原菌的抗微生物制劑的補(bǔ)充療法［16］。

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