范仕郡，劉 鑫，黃 敏，王 寧，鄭 江 （第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038）

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的快速提取及培養(yǎng)

范仕郡，劉 鑫，黃 敏，王 寧，鄭 江 （第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038）

目的建立一種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞快速提取的方法，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供便捷。方法 用生理鹽水灌洗小鼠腹腔，分離獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)入高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用臺盼藍(lán)染色計(jì)算存活率，瑞氏染色計(jì)算純度，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 獲得較高純度的巨噬細(xì)胞，具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。結(jié)論 本方法是一種簡便實(shí)用的提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的方法。

BALB/c小鼠;巨噬細(xì)胞;提取;培養(yǎng);鑒定

巨噬細(xì)胞是一類重要的天然免疫細(xì)胞，來源于外周血中的單核細(xì)胞，具有吞噬降解細(xì)菌、釋放炎癥介質(zhì)、介導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化、抗原提呈等活性，在抗感染、抗腫瘤免疫中發(fā)揮著非常重要的作用［1-2］。因此研究巨噬細(xì)胞的功能，對于深入理解機(jī)體免疫防御和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。獲取原代細(xì)胞是體外研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。巨噬細(xì)胞在肺、肝、腦等實(shí)質(zhì)器官以及腹腔等空腔部位以不同的形式分布。國內(nèi)外已有不少文獻(xiàn)報(bào)道從多種組織器官中成功分離和純化巨噬細(xì)胞［3-5］。然而在實(shí)質(zhì)臟器中的巨噬細(xì)胞，往往受到環(huán)境介質(zhì)中各種理化和生物刺激因素的影響，已發(fā)生炎性活化或產(chǎn)生了定向分化，為其體外研究造成了干擾。而腹腔中存在大量靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，且腹腔中細(xì)胞種類較少簡單，易于分離，是獲取巨噬細(xì)胞的常用部位［6-9］。目前有關(guān)腹腔巨噬細(xì)胞的分離方法較為復(fù)雜，且操作耗時較長。本方法在既往文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上，對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取方法加以改良，建立了一種更為簡便實(shí)用的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用材料及試驗(yàn)設(shè)備有:8周齡BALB/c雌性小鼠（由北京華阜康生物科技股份有限公司提供）、生理鹽水、膠頭滴管、75%乙醇、眼科剪、眼科鑷、10 mL一次性注射器、50 mL離心管、臺盼藍(lán)、瑞氏染液、奧林巴斯IX71倒置顯微鏡、奧林巴斯E400顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 將眼科剪、眼科鑷、膠頭滴管高壓滅菌;離心管輻照消毒;BALB/c小鼠3只禁食8 h;實(shí)驗(yàn)前將超凈臺紫外線消毒30 min。

1.2.2 細(xì)胞提取 將小鼠脫頸椎處死，并浸入75%乙醇中10 s。然后取出小鼠，瀝干，將其仰臥于不銹鋼方盤上。用注射器吸6 mL生理鹽水液注入腹腔中，輕揉小鼠腹部2 min，使液體在腹腔內(nèi)充分流動。用眼科鑷提起下腹皮膚，使動物微傾向一側(cè)。剪開腹部皮膚后在肌肉層剪1個小口，用膠頭滴管將腹腔液吸出轉(zhuǎn)入離心管中。每只吸出量約為4～5 mL。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 在4℃條件下，將收集的腹腔灌洗液在1 000 r/min條件下離心10 min，去上清，加入高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。顯微鏡下（10×100倍）計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至所需，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，充分貼壁后，棄上清，除去非粘附細(xì)胞再加入高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

2 結(jié)果

2.1 臺盼藍(lán)染色、瑞氏染色結(jié)果

分別用臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)（圖1a）、瑞氏染色計(jì)算純度（圖1b）。臺盼藍(lán)染色后，3 min內(nèi)，鏡下分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞呈無色透明狀。細(xì)胞活力（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100% ＞95%。瑞氏染色后，在鏡下通過細(xì)胞形態(tài)計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)。巨噬細(xì)胞獲得率（%）=巨噬細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100% ＞90%。

圖1 提取細(xì)胞臺盼藍(lán)染色、瑞氏染色（×1 000）

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞呈橢圓形、多角形或不規(guī)則形，部分貼壁（圖2a）。培養(yǎng)24 h后觀察可以觀察到細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶，大部分出現(xiàn)偽足。部分細(xì)胞伸展開并牢固粘附在培養(yǎng)瓶表面（圖2b）。

圖2 培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)

3 討論

在鑒定細(xì)胞方面，采用臺盼藍(lán)染色其原理是活細(xì)胞的胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)，不能著色。反之死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，臺盼藍(lán)進(jìn)入后被染成藍(lán)色。因此，采用臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞非常簡便快捷，是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)典的鑒定染色方法。瑞氏染液為中性染料，它使細(xì)胞核及胞漿著色。染液中含有緩沖液來調(diào)節(jié)酸堿度，因此細(xì)胞染色后，藍(lán)色和紅色都比較適中，細(xì)胞核、胞漿顯色都非常清楚，是目前在細(xì)胞染色中最簡單和常用的方法。在細(xì)胞的提取過程中要注意無菌操作，注意器械和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的消毒。選用雌性小鼠是因其腸壁脂肪較少，方便腹腔液的收集。周齡較大的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，最好選用6～8周齡小鼠。

巨噬細(xì)胞廣泛分布于體內(nèi)，它不僅在非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且也是機(jī)體特異性免疫中的一類關(guān)鍵細(xì)胞［10-11］。由于腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在，易于獲得，因此，許多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行基礎(chǔ)或配合臨床研究巨噬細(xì)胞功能及其與疾病的關(guān)系、或篩檢免疫增強(qiáng)藥物和探討其作用機(jī)制時，往往選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象［12-13］。本方法在提取時，和其他方法一樣，均是灌洗腹腔后，吸出含有巨噬細(xì)胞的灌洗液，然后離心培養(yǎng)。但傳統(tǒng)方法中均采用淀粉肉湯、無菌液體石蠟等腹腔注射預(yù)刺激幾天，以提高其獲得率。預(yù)刺激處理一方面增加了操作的復(fù)雜程度，另一方面可影響分離巨噬細(xì)胞的靜息特征。本方法實(shí)驗(yàn)前不需預(yù)刺激，減少了污染概率，大大縮短了細(xì)胞獲取的準(zhǔn)備時間，所得的巨噬細(xì)胞活力和獲得率均大于90%。因此，此方法是一種簡便實(shí)用的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取方法，為巨噬細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯:周小林）

Establishment of a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages

FAN Shi-jun，LIU Xin，HUANG Min，WANG Ning，ZHENG Jiang （Central Laboratory，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

ObjectiveTo establish a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages.MethodsAbdominal lavage was performed with NS and the peritoneal macrophages was purified from the lavage，which was later transferred into high glucose DMEM culture medium.Cell viability was measured via the typan blue staining.Purity was observed via Wright＇s stain.ResultsHigh purity macrophages with typical morphology were obtained.ConclusionA simple and realistic method was set up for the isolation of murine peritoneal macrophages.

BALB/c mice;macrophage;extraction;culture;identification

Q813.1

A

1672-5042（2015）02-0130-02

10.11659/jjssx.11E014005

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81171781）

2014-11-12

2014-12-20