羅 偉，李 鋒，熊 偉，高仕長(zhǎng) （.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 40006;.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北武漢 430000）

剪切力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞休眠狀態(tài)的誘導(dǎo)作用

羅 偉1，2，李 鋒2，熊 偉2，高仕長(zhǎng)1（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，湖北武漢 430000）

目的探討層流剪切力（LSS）對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）增殖和凋亡的影響。方法 選擇間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），并對(duì)其進(jìn)行體外流體剪切力力學(xué)加載（生理范圍內(nèi)）;通過(guò)DNA合成了解增殖情況，采用流式細(xì)胞儀及PCR技術(shù)檢測(cè)其凋亡情況。結(jié)果 在生理范圍內(nèi)的流體力學(xué)加載，細(xì)胞增殖與其加載力相關(guān);該范圍內(nèi)的力學(xué)刺激對(duì)MSCs的凋亡起抑制作用。結(jié)論 生理范圍內(nèi)的流體剪切力誘導(dǎo)MSCs進(jìn)入休眠狀態(tài)。

間充質(zhì)干細(xì)胞;剪切力;細(xì)胞周期抑制;凋亡

人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)很大程度上受到外部力學(xué)的調(diào)控［1］。血管系統(tǒng)在力的刺激下發(fā)生形變，進(jìn)而引起血管內(nèi)的血液發(fā)生流變［2］。該流變的產(chǎn)生是在應(yīng)力下骨骼變形，導(dǎo)致骨小梁發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致流體力的產(chǎn)生，其流變包括層流剪切力（fluid shear stress，LSS）。該流變刺激血竇成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。現(xiàn)階段對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的力學(xué)影響已有詳盡的研究，然而對(duì)其來(lái)源細(xì)胞－間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）還沒(méi)有充分的研究［3-4］。人體內(nèi)的MSCs有分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的潛能［5］。處于血竇旁的MSCs能感應(yīng)到流變力學(xué)的刺激［6］。流變力學(xué)在人體內(nèi)的加載范圍為 8～30 dynes/cm2［7-8］。

間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力為組織工程的種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)，在修復(fù)梗死的心肌及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。目前的研究多集中在分化能力本身，在力學(xué)影響方面的關(guān)注較少。我們假設(shè)MSCs可以感受生理范圍內(nèi)的LSS的刺激，探討生理范圍內(nèi)的LSS對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)）;胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）;胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（Amersco公司，美國(guó)）;Annexin V-FITC免疫熒光凋亡檢測(cè)試劑盒（北京中山公司）;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4～5周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量100～150 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

遵從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的倫理學(xué)法規(guī)。SD大鼠引頸處死后分離股骨，在股骨骨髓腔中取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。直到細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)（2周左右）。利用平行板流動(dòng)腔裝置進(jìn)行LSS加載。平行板流動(dòng)腔由Frangos首先采用，其原理由Daculis論證，在我們實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過(guò)Ke Bai使用［9-11］。該力學(xué)加載為生理范圍內(nèi)，即1～15-dyne/cm2。待細(xì)胞融合后立即進(jìn)行層流剪切力加載（1，5，15-dyne/cm2）。在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，用Lowry方法進(jìn)行驗(yàn)算。收集到（4～5）×105/L數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞，用70%乙醇（冰）固定。經(jīng)過(guò)RNase消化后，再由propidium iodide（PI）染色，最后進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)LSS力學(xué)加載后使用Annexin V-FITC免疫熒光凋亡檢測(cè)試劑盒（步驟見(jiàn)試劑盒指南）。接受檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量每次不低于（4～5）×105/L。用Invitrogen公司的Trizol提取RNA，來(lái)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因（Bcl-2和Bax）。采用PBG，來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化mRNA的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LSS對(duì)MSCs DNA合成的影響

力學(xué)加載強(qiáng)度為1、5、15-dyne/cm2層流剪切力;時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)為0、4、12、24 h;加載15-dyne/cm2LSS 后 MSCs的 DNA 合成明顯抑制。加載4 h后DNA的合成明顯減少（64.3%），隨后24 h繼續(xù)減少（44.5%）。5-dyne/cm2LSS力學(xué)加載時(shí)細(xì)胞DNA合成受抑制。減低力學(xué)加載（1-dyne/cm2）未見(jiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制。上述提示1-dyne/cm2和5-dyne/cm2之間的某個(gè)力學(xué)加載點(diǎn)，MSCs增殖抑制現(xiàn)象開始出現(xiàn)（圖1）。

2.2 LSS對(duì)細(xì)胞周期的影響

對(duì)細(xì)胞加載生理范圍內(nèi)的LSS，我們可以發(fā)現(xiàn)處于增殖期的細(xì)胞比率（S-G2/M）隨時(shí)間增加而下降。力學(xué)加載強(qiáng)度分別為:1、5、15-dyne/cm2層流剪切力;不同時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)為:0、4、12、24 h。在不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)如下:4 h為22.31%;12 h為13.64%;24 h為11.50%（圖2）。

圖1 時(shí)間相關(guān)的MSCs增殖抑制作用

2.3 LSS介導(dǎo)的細(xì)胞周期

細(xì)胞凋亡的驗(yàn)證是通過(guò)凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞膜的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)構(gòu)顯示生理范圍內(nèi)的力學(xué)加載（LSS 15-dyne/cm2）對(duì)細(xì)胞凋亡起到抑制作用。不同的時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)為:0、4、12、24 h;在不同的時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)如下:4 h活細(xì)胞比率82.37%（對(duì)照組59.39%）;這一數(shù)據(jù)在24 h得到進(jìn)一步維持（圖3）。

2.4 MSCs凋亡相關(guān)基因（Bcl-2/Bax）表達(dá)

力學(xué)加載強(qiáng)度為1、5、15-dyne/cm2層流剪切力;檢測(cè)點(diǎn)為12 h檢測(cè)凋亡相關(guān)基因（Bcl-2/Bax）表達(dá)。結(jié)果顯示生理范圍內(nèi)的層流剪切力對(duì)MSCs有抗凋亡作用?？沟蛲龌虻谋磉_(dá)增加，與促凋亡基因的比值（Bcl-2/Bax）隨時(shí)間增加而增加（圖4）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示細(xì)胞體外培養(yǎng)中，LSS使MSCs增殖被抑制，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。LSS通過(guò)影響MSCs進(jìn)入S期來(lái)抑制其增殖，因?yàn)閷0/G1期的MSCs暴露在LSS之后，S期的細(xì)胞跟G2/M期的細(xì)胞數(shù)量都減少，提示層流剪切力是通過(guò)影響細(xì)胞進(jìn)入S期來(lái)達(dá)到抑制細(xì)胞增殖。我們進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)生理范圍內(nèi)的力學(xué)加載，細(xì)胞的線粒體代謝水平受到影響。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)表達(dá)在細(xì)胞外膜上的磷脂酰絲減少［12］（加載1 h減少30%，加載24 h減少40%）。我們?cè)龠M(jìn)一步檢測(cè)凋亡調(diào)節(jié)基因（Bcl-2/Bax）的mRNA表達(dá)，LSS的處理使凋亡調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)向MSCs的存活率升高的一邊，同時(shí)檢測(cè)到Bcl-2的表達(dá)以及Bcl-2/Bax的比率增高。在LSS處理MSCs開始1 h后，上述作用開始出現(xiàn)，且呈時(shí)間依賴性。層流剪切力的加載導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡能力增加?；A(chǔ)研究證實(shí)細(xì)胞抗凋亡是通過(guò)調(diào)節(jié)p27來(lái)實(shí)現(xiàn)的，反映了其抗凋亡作用［13］。因此，我們認(rèn)為L(zhǎng)SS是MSCs在體外培養(yǎng)中的一個(gè)重要存活因素。

圖2 層流剪切力對(duì)細(xì)胞周期影響

這些調(diào)節(jié)反應(yīng)在過(guò)表達(dá)BCL-2或者BCL-x（L）的細(xì)胞中更加突出［14］。在流體力學(xué)的作用下，細(xì)胞的物質(zhì)交換相對(duì)于靜止細(xì)胞明顯增加，這可能是該實(shí)驗(yàn)細(xì)胞低凋亡率的一個(gè)重要原因。Frisch教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)整合素信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中起到重要作用［15］。也與 VEGF 及其受體表達(dá)相關(guān)［16］。我們的研究發(fā)現(xiàn)層流剪切力可能通過(guò)ERK信號(hào)旁路導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起細(xì)胞周期的停滯。我們的研究和其他研究［17］都證實(shí)了生理范圍內(nèi)的層流剪切力對(duì)MSCs維持靜息期以及保持干細(xì)胞池的作用，這為MSCs移植作為潛在方法治療心肌壞死或者免疫抑制提供了重要的信息，因?yàn)檠鲗⒖赡芨淖円浦布?xì)胞的功能。

圖3 LSS（15-dyne/cm2）對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖4 LSS對(duì)細(xì)胞凋亡（Bcl-2/Bax）的影響

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（編輯:左艷芳）

Laminar shear stress result in maintaining the quiescence of MSCs

LUO Wei1，2，LI Feng2，XIONG Wei2，GAO Shi-chang1（1.Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016;2.Department of Orthopedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of laminar shear stress（LSS）on the proliferation and apoptosis of mesenchymal stem cells（MSCs）.MethodsThe influences of laminar shear stress（the physiological levels）on MSCs were studied.DNA synthesis and cell cycle were measured，to detect the cellular proliferation.The apoptosis-related gene expression（Bcl-2/Bax）was examined to determine the effect of LSS.ResultsThe percentage of MSCs’proliferation rate was reduced by the fluid shear stress.Furthermore，it was detected that LSS exerted a potent suppression effect on MSC apoptosis.ConclusionThese data revealed a critical role of LSS in maintaining the quiescence of MSCs.

mesenchymal stem cells;shear stress;cell cycle arrest;apoptosis

R329.25

A

1672-5042（2015）02-0123-04

10.11659/jjssx.01E015005

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（30772206）

高仕長(zhǎng)，電話:（023）89012566

2014-12-16

2015-01-20