梁金龍+++張健莉+++羅守娟+等

[摘要] 目的 應用iTRAQ技術(shù)分析絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌組織差異蛋白的表達情況，旨在探討絕經(jīng)對三陰性乳腺癌發(fā)生的影響。 方法 選擇絕經(jīng)前及絕經(jīng)后各8例經(jīng)病理確診的三陰性乳腺癌患者，應用iTRAQ技術(shù)分析差異蛋白顯著性功能、差異蛋白pathway并進行差異蛋白驗證。 結(jié)果 （1）絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經(jīng)后的差異蛋白較多，且分布較散。（2）絕經(jīng)前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中；絕經(jīng)后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。（3）與癌旁組織相比，絕經(jīng)前共有214種顯著差異蛋白，絕經(jīng)后共有360種顯著差異蛋白。絕經(jīng)前的三陰性乳腺癌組織中上調(diào)蛋白81種，下調(diào)蛋白133種，絕經(jīng)后上調(diào)蛋白157種類，下調(diào)203種。 結(jié)論 利用iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌患者差異蛋白表達具有一定的特殊性，說明不同雌激素環(huán)境下三陰性乳腺癌可能存在不同發(fā)病機制，可能成為治療TNBC的新靶點。

[關(guān)鍵詞] 三陰性乳腺癌；絕經(jīng)前后； iTRAQ技術(shù)；差異蛋白

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）02-0001-04

三陰性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受體（progesterone receptor，PR）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均為陰性表達的乳腺癌，其多發(fā)于初潮及足月懷孕年齡早、哺乳期短，特別是絕經(jīng)前的婦女[1]。目前手術(shù)、化療及新輔助化療和靶向治療為常用治療TNBC方法。其中分子靶向治療以腫瘤細胞的特征性改變?yōu)樽饔冒悬c，在發(fā)揮更強的抗腫瘤作用的同時減少對正常細胞的毒副作用。目前TNBC治療靶點的篩查工作已取得了一定的研究進展，其中差異蛋白質(zhì)組學的方法被認為是目前篩選TNBC臨床治療靶點最為有效的研究方法之一。差異蛋白質(zhì)組學的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術(shù)、應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)等分離技術(shù)及質(zhì)譜鑒定技術(shù)[2]。近年來人們對iTRAQ技術(shù)的應用日漸開展起來，然而將iTRAQ技術(shù)應用于三陰性乳腺癌機制研究及靶向位點的探討至今仍較少。本研究以絕經(jīng)前和絕經(jīng)后三陰性乳腺癌患者癌組織和癌旁正常組織為實驗材料，利用iTRAQ技術(shù)分析絕經(jīng)前和絕經(jīng)后三陰性乳腺癌和癌旁正常組織蛋白差異表達譜，進而分析絕經(jīng)前和絕經(jīng)后差異蛋白的特異性，旨在探討絕經(jīng)對三陰性乳腺癌發(fā)生產(chǎn)生的影響，從而為三陰性乳腺癌的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月～2014年1月間我院收治的絕經(jīng)前及絕經(jīng)后各8例經(jīng)病理確診的三陰性乳腺癌患者，病理類型均為導管腺癌。絕經(jīng)前8例TNBC患者的年齡范圍為40～53歲。絕經(jīng)后8例TNBC患者的年齡范圍為59～81歲。16例三陰性乳腺癌患者的病例資料見表1。

1.2 實驗過程

1.2.1 SDS-PAGE （1）組織標本處理：取術(shù)后新鮮的乳腺癌組織及距腫瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺組織，切成小塊，稱重，分裝，置-80℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。?）總蛋白制備：①取50 μg低溫冷凍的樣品置于液氮預冷的研缽中，邊加入液氮邊研磨，直至樣品呈現(xiàn)白色粉末狀，收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS，振蕩器混勻，超聲波破碎，重復3次，每次間隔3 min。③置冰上1 h，并間歇震蕩。④4℃，15 000 rpm離心30 min，重復2次，樣品分層后用移液器小心地將中層清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液，冰上沉淀2 h。⑥4℃，15 000 rpm離心20 min，棄上清，加入1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃，15 000 rpm離心15 min，留取沉淀，在空氣中晾干。⑧將250 μL 加入RS晾干沉淀，渦旋振蕩器上混勻，30℃金屬浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm離心10 min，留取上清，即為組織總蛋白溶液。（3）總蛋白濃度測定：①準備兩組8個1.5 mL離心管，每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再分別加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1號管不含牛血清白蛋白的作空白對照。②每管各加入1 mL考馬斯亮藍染料溶液。③比色測OD595。（4）SDS-PAGE：①準備SDS-PAGE凝膠。②將樣品與SDS樣品緩沖液混合，同樣準備蛋白質(zhì)分子量標準物。③上樣：取15 μL蛋白樣品上樣，12% SDS-PAGE電泳，電極緩沖液為Tris-甘氨酸電泳緩沖液。按次序上樣，一定安排已知分子量的標準物。④電泳。⑤取下凝膠，考馬斯亮藍或銀染色染色觀察分析。

1.2.2 酶解及iTRAQ標記 （1）樣品處理：每組取120 μg樣品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA溶液混勻，轉(zhuǎn)入30 kd超濾離心管，離心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液，離心14000 g 15 min，棄濾液。加入100 μL IAA，600 rpm振蕩1 min，避光室溫30 min，離心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液，離心14000 g 10 min重復2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3，離心14000 g 10 min重復2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振蕩1 min，37℃ 16～18 h。換新收集管，離心14000 g 10 min，收集濾液。（2）蛋白質(zhì)含量測定：同1.2.1。（3）同位素標記：從每組取等量肽段（約100 μg），按照試劑盒說明書進行標記。

1.2.3 肽段的分離及鑒定 分別進行強陽離子交換層析分級分離、毛細管高效液相色譜分離、ESI質(zhì)譜鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

（1）質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用Sequest軟件鑒定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析，依據(jù)同位素報告基因的相對含量進行蛋白質(zhì)定量。（2）生物信息學分析：分析差異蛋白在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中的分布狀況，利用Cluster軟件進行蛋白功能注釋，基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白基因進行通路注釋，得到差異蛋白基因所參與的所有的通路，利用Fisher精確檢驗計算每個通路的顯著性水平，并對多重假設檢驗的結(jié)果進行校正并獲得誤判率，從而篩選出差異基因參與的顯著通路[3]。

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白顯著性功能分析

絕經(jīng)前在已鑒定的差異量2倍以上的214種蛋白中，具有Go注釋的有89種，其中12種蛋白參與小分子代謝，10種蛋白參與細胞粘附，7種參與炎癥反應，7種參與調(diào)節(jié)基因表達。見封三圖1。絕經(jīng)后已鑒定的差異量2倍以上的360種蛋白中，具有Go注釋的有156種，其中24種蛋白參與小分子代謝，12種蛋白參與細胞粘附，8種參與炎癥反應，15種參與調(diào)節(jié)基因表達，12種具有信號轉(zhuǎn)導功能，3種參與凋亡反應，17種發(fā)揮轉(zhuǎn)運功能，20種參與血液凝固，2種參與細胞內(nèi)蛋白代謝過程，見封三圖2。將絕經(jīng)前和絕經(jīng)后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經(jīng)后的差異蛋白較多，且分布較散。見封三圖3、4。

2.2 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白Pathway分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway注釋，得到差異基因所參與的所有途徑。絕經(jīng)前有ECM-受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、互補及凝固級聯(lián)反應和聚集粘附這5種途徑為差異基因顯著參與的途徑。絕經(jīng)后具有15種特異的Pathway，差異蛋白參與的途徑包括粘著斑、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等。

2.3 絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白驗證分析

采用iTRAQ技術(shù)不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。結(jié)果顯示，在絕經(jīng)前后兩組共鑒定1254種蛋白質(zhì)，其中1243種有定量信息。選擇表達量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白，與乳腺癌旁組織相比，絕經(jīng)前（premenopause）共有214種顯著差異蛋白，絕經(jīng)后（Hpost-menopauseH）共有360種顯著差異蛋白（表2）。

表2 絕經(jīng)前后TNBC患者顯著差異蛋白（與乳腺癌旁組織相比）（個）

3 討論

三陰性乳腺癌其發(fā)病及致病機制比較復雜，激素環(huán)境一直被認為是TNBC致病潛在重要的影響因子之一[7]。經(jīng)期是激素變化的顯著階段，絕經(jīng)前與絕經(jīng)后體內(nèi)激素發(fā)生很大的變化，其中雌激素越多，絕經(jīng)女性患某些乳腺癌的幾率相對越大[4]。目前，尚無絕經(jīng)與TNBC關(guān)系的研究報道，是否絕經(jīng)對三陰性乳腺癌發(fā)生具有影響，絕經(jīng)前后不同激素水平條件下三陰性乳腺癌發(fā)生的機制是否存在差異，至今未知。

三陰性乳腺癌的治療目前還沒有一個明確的、行之有效的靶向治療單劑，其中分子靶向治療是目前治療癌癥的有效手段，且TNBC的治療靶點的篩查工作已取得了一定的研究進展，其中差異蛋白質(zhì)組學的方法被認為目前篩選臨床治療靶點最為有效的研究方法之一[5]。差異蛋白質(zhì)組學的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術(shù)、應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)等分離技術(shù)及質(zhì)譜鑒定技術(shù)。由于凝膠電泳仍具有低靈敏度、無法檢測低豐度蛋白的局限，因此近期人們比較關(guān)注同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)的應用[6-8]。與凝膠為基礎的定量方法比較，iTRAQ技術(shù)可捕獲全蛋白、且無需凝膠電泳、同時可進行多樣品分析，從而成為研究三陰性乳腺癌靶向位點的有力手段之一[9，10]。然而iTRAQ技術(shù)應用到三陰性乳腺癌機制研究及靶向位點的探索至今仍較少。iTRAQ技術(shù)是采用4種或8種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技術(shù)探討子宮內(nèi)膜癌的差異蛋白，并發(fā)現(xiàn)chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9種蛋白可以作為潛在的靶向治療位點。

本研究應用iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS，在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后兩組中共鑒定1254種蛋白質(zhì)，其中1243種有定量信息。選擇表達量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白，與癌旁組織相比，絕經(jīng)前共有214種顯著差異蛋白，絕經(jīng)后共有360種顯著差異蛋白。其中與癌旁組織相比，絕經(jīng)前的三陰性乳腺癌組織中上調(diào)蛋白81種，下調(diào)蛋白133種，絕經(jīng)后上調(diào)蛋白157種類，下調(diào)203種，絕經(jīng)前后差異蛋白表達并不完全一致，說明絕經(jīng)前后TNBC患者的蛋白表達情況具有一定的差異性及特殊性。在這些差異表達的蛋白中，有一些功能尚不十分清楚，而有一些與腫瘤密切相關(guān)。且本研究將絕經(jīng)前和絕經(jīng)后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜（封三圖3、4），結(jié)果顯示，絕經(jīng)前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經(jīng)后的差異蛋白較多，且分布較散。同時我們對絕經(jīng)前后的TNBC患者差異蛋白的通路分析顯示：絕經(jīng)前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中；絕經(jīng)后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。絕經(jīng)前后的TNBC患者共同存在的差異蛋白主要體現(xiàn)在三條顯著途徑，分別為ECM-受體相互作用途經(jīng)、蛋白質(zhì)消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)，而絕經(jīng)后也有獨特的差異顯著通路，推測以絕經(jīng)為界限，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后的TNBC具有不同的致病機制[12]。共同的通路是三陰性乳腺癌的共性致病調(diào)控途徑，而絕經(jīng)后仍存在12種調(diào)控途徑，包括粘著斑、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等相關(guān)蛋白，具有一定特性，因此根據(jù)絕經(jīng)前后致病機制的不同，可以選擇不同的治療方案，為針對性治療三陰性乳腺癌指明方向。

總之，本研究中我們應用iTRAQ技術(shù)對絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌及癌旁正常組織的蛋白質(zhì)組進行比較分析，確定了差異表達的蛋白，并對這些蛋白進行了功能分析，確定了這些差異蛋白顯著參與的信號轉(zhuǎn)導途徑，但這些差異蛋白在絕經(jīng)前后三陰性乳腺癌具體通過什么機制、如何發(fā)揮作用還需要繼續(xù)進行大樣本進一步深入地研究。

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（收稿日期：2014-10-30）