Discussion on development ofdetection method for food microorganism

梁華麗*方　毅（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾　516600）

*梁華麗，女，1982年出生，2004年畢業(yè)于湛江海洋大學水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)，助理工程師。

簡析食品微生物檢測技術(shù)進展

Discussion on development ofdetection method for food microorganism

梁華麗*方毅
（汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東汕尾516600）

*梁華麗，女，1982年出生，2004年畢業(yè)于湛江海洋大學水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)，助理工程師。

1　食品微生物檢測技術(shù)的進展及研究

1.1分析化學檢測技術(shù)的進展及研究

近年來，在食品微生物檢測技術(shù)中，隨著應(yīng)用儀器與技術(shù)的不斷更新，分析化學檢測技術(shù)也朝著多元化的方向發(fā)展。分析化學檢測技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測、高效液相色譜檢測、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測、氣相色譜檢測等。分析化學檢測技術(shù)主要是通過對食品微生物化學組成的分析來進行鑒定與區(qū)分。此種檢測技術(shù)的應(yīng)用，開辟了食品微生物檢測與鑒定的新途徑，對微生物檢測的準確性有著顯著的促進作用。

1.2 PCR檢測技術(shù)的進展及研究

PCR檢測技術(shù)是利用聚合酶鏈反應(yīng)，將模板DNA、Taq酶、鎂離子、雙蒸水、緩沖液等混合物裝入PCR微型管內(nèi)，并在可編程調(diào)控的PCR儀上來完成檢測。PCR檢測技術(shù)自從1985年發(fā)明以來，通過不斷地完善與改進，應(yīng)用于食品微生物檢測中時具有較高的敏感性與準確性。PCR檢測技術(shù)包括免疫PCR、多重PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，每種PCR檢測技術(shù)都可準確地檢測到相對應(yīng)的病菌與微生物，但其也主要是針對食品中病原菌的特異性靶基因進行定位檢測，且PCR檢測技術(shù)還存在假陽性、定量困難等問題，還需進一步完善。

1.3核酸探針檢測技術(shù)的進展及研究

核酸探針技術(shù)主要是利用同位素或其他標記方法，對已知核苷酸的序列DNA片段進行標記，并將其加入已變異的DNA樣品當中，進而通過一定的條件作用達到食品微生物檢測的目的。核酸探針技術(shù)檢測食品微生物具有敏感性、特異性等優(yōu)勢，但其在檢測時需對檢測樣品進行一段時間的培養(yǎng)，且檢測方法及過程比較復(fù)雜，并對毒素污染的不含產(chǎn)毒菌的食品無法進行準確檢測。

1.4免疫分析檢測技術(shù)的進展及研究

免疫分析檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)與免

疫熒光技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是將抗體或抗原吸附于固相載體上并進行免疫酶染色，待底物顯色后，再由定量或定性來分析有色產(chǎn)物量，進而得到微生物的檢測結(jié)果。此種檢測技術(shù)結(jié)合了放射免疫測定法與免疫熒光法兩者的優(yōu)勢，具有反應(yīng)靈敏、準確性高、可定量、適用范圍廣等優(yōu)點。近年來，隨著酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的完善，對檢測食品中沙門氏菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等檢測做出了卓越的貢獻。

免疫熒光技術(shù)主要是在食品樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，并經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下進行觀察，從而得出檢測結(jié)果；另外，也可采用間接法先在檢樣上滴加已知特異性熒光標記的抗血清，待其產(chǎn)生反應(yīng)后再進行洗滌，并加入熒光標記的抗體進行觀察。免疫熒光技術(shù)主要可用來檢測葡萄球菌毒素、李斯特菌、沙門氏菌等，其特異性強、敏感性高、檢測速度快，但也存在一些客觀性的不足，還有待進一步再研究與改進。

1.5生物傳感器檢測技術(shù)的進展及研究

對食品微生物以生物傳感器檢測技術(shù)進行檢測時，其主要是將生物受體復(fù)合物（包括酶、核酸、抗體、多糖化合物等）與物理化學傳感器直接連接，并通過動態(tài)、實時觀察特異性生物，來分析其微生物的種類。生物傳感器檢測技術(shù)包括有免疫傳感器、酶傳感器、DNA雜交傳感器、微生物傳感器等，雖然其在食品微生物檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用比較廣泛，但其敏感性還存在一定程度的欠缺，具體的發(fā)展與完善有待進一步研究。

1.6放射測量檢測技術(shù)的進展及研究

放射測量技術(shù)作為化學與物理相結(jié)合的一種微生物檢測技術(shù)，主要是對培養(yǎng)基內(nèi)的微生物進行檢測。放射測量法的檢測原理比較簡單，其檢測方法類似于碳元素追蹤法，通過利用培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長、繁殖的過程，來確定樣品中微生物的存在與種類。放射測量檢測技術(shù)具有簡單、準確、快速、自動化等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品微生物中大腸埃希菌的定量檢測當中。

1.7電阻抗檢測技術(shù)的進展及研究

電阻抗檢測技術(shù)的檢測原理是培養(yǎng)基中微生物在不斷生長過程中，可將其電惰性底物代謝成為活性底物，進而使得培養(yǎng)基中電導(dǎo)性增大，且培養(yǎng)物的阻抗降低。另外，培養(yǎng)基中微生物在生長過程中可產(chǎn)生一種特征性阻抗曲線，可依據(jù)電阻改變的圖形對檢測細菌進行鑒定。電阻抗檢測技術(shù)具有反應(yīng)速度快、重復(fù)性好、敏感性與特異性強等優(yōu)點，在食品微生物檢測中的應(yīng)用比較廣泛。

2　食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢

基于食品微生物檢測技術(shù)中目前存在的不足之處，對其發(fā)展趨勢進行了分析。

2.1標準化與國產(chǎn)化

從我國目前對食品微生物的檢測情況來看，大多數(shù)檢測都是采用國外的快速檢測法，這也造成了檢測成本高，缺乏國家相應(yīng)的標準等缺點。因此，大力在引進并融合國外的先進技術(shù)，研究出符合我國檢測產(chǎn)品標準的檢測技術(shù)，同時還需加大力度建立國家標準與規(guī)范。

2.2提高質(zhì)量與準確性

應(yīng)用新工藝、高科技，提高與實驗相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，并優(yōu)化設(shè)計特殊培養(yǎng)基，進而提高檢測技術(shù)的靈敏度與特異性。

2.3充分發(fā)揮各檢測技術(shù)的優(yōu)勢

在進行食品微生物檢測時，必須熟知各種檢測技術(shù)的優(yōu)缺點，有效地做到揚長避短，從而使其檢測技術(shù)能夠最大程度地發(fā)揮自己的優(yōu)勢。

3　快速檢測法在食品微生物檢測中的應(yīng)用

3.1傳統(tǒng)檢測法

食品微生物檢測的傳統(tǒng)方法主要包括瓊脂平板培養(yǎng)法及顯微鏡鏡檢法。

a）瓊脂平板培養(yǎng)法：①選擇性培養(yǎng)基檢測法，各種微生物對不同化學物質(zhì)的敏感程度也有所不同，因此在瓊脂平板培養(yǎng)基中，適當加入對非目的微生物生長產(chǎn)生抑制效果的化學制劑，可促進目的微生物生長并利于檢測；②顯色培養(yǎng)基檢測法，其基礎(chǔ)為生物化學反應(yīng)，在瓊脂平板培養(yǎng)基中加入細菌特異性酶顯色底物，使不同菌落產(chǎn)生對應(yīng)的顏色變化，根據(jù)所需檢測目的微生物顯色情況直接判斷該微生物的存在及數(shù)量，目前常用于檢測食品中致病菌。但有研究顯示，部分目標微生物存在混合感染情況時，利用該方法易出現(xiàn)假陰性，影響檢測結(jié)果。

b）顯微鏡鏡檢法（油鏡檢測）：使檢測樣品富

集后（提高濃度）滴至載玻片，將蓋玻片蓋好后滴入香柏油鏡檢。

3.2現(xiàn)代檢測法

隨著現(xiàn)代生物及化學技術(shù)不斷發(fā)展，氣相色譜法、免疫學檢測法、傳感器檢測法、分子生物學檢測法、自動檢測法、抗阻測定法、“即用膠”測定法等新型食品微生物檢測方法已廣泛應(yīng)用于實際工作中，并取得顯著效果。

3.2.1氣相色譜法

經(jīng)水解、分離提?。状迹?、硅烷化、甲基化等處理后，微生物細胞將分離成多種化學組分，利用氣相色譜分析儀對其進行分析后得出相應(yīng)色譜，根據(jù)色譜所顯示峰值準確鑒定食物中所含微生物，目前常用于檢測霉菌、酵母菌及某些常見細菌等。

3.2.2免疫學檢測法

免疫學檢測法主要包括：①酶免疫檢測法（EIA），包括均相法及非均相法，其分類依據(jù)為檢測中抗原體反應(yīng)是否需要對酶標記物進行分離結(jié)合及游離。非均相法是目前常用的酶免疫檢測方法，其代表方法為酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），固相載體吸附抗體或抗原后進行免疫酶染色，待底物顯色后對有色產(chǎn)物進行定量或定性分析，從而確定樣品中是否含有目標微生物及其數(shù)量，該方法特點為標記物穩(wěn)定、操作簡便、靈敏度高、可準確定量微生物、適用范圍廣泛、快速廉價等，可同時進行大量（上千份）樣品檢測；②免疫層析技術(shù)（IC），其原理為利用毛細管作用，在條狀纖維所制膜上（含有相應(yīng)配體）使樣品泳動，目的在于使樣品與膜上特定區(qū)域配體結(jié)合，利用酶促顯色反應(yīng)或直接著色標記物獲得直觀結(jié)果，該方法目前已開發(fā)出針對性的試紙條應(yīng)用于食品微生物檢測中，可快速獲得檢測結(jié)果，且準確性較高，但無法進行定量檢測；③免疫磁珠分離法（IMS），其原理為免疫化學技術(shù)與磁性微球結(jié)合，使樣品與磁珠（由抗體包被）混合后利用磁場將其收集；④免疫熒光法（IFT），在抗體或抗原上標記熒光色素，待相互結(jié)合后于熒光顯微鏡下利用熒光反應(yīng)觀察結(jié)果，需注意此方法中所用熒光色素應(yīng)未對待檢樣品中目標微生物活性造成影響；⑤乳膠凝集試驗（LAT），抗體使用人工大分子乳膠顆粒標記后，將待測微生物與其發(fā)生凝集，從而達到檢測目的，該方法檢測結(jié)果較為直觀（肉眼可見）；⑥酶聯(lián)熒光免疫法（ELFIA），將酶免疫與熒光免疫結(jié)合，利用合適的熒光底物代替生色底物后進行酶免疫分析，可有效擴大檢測范圍及減少試劑使用量，靈敏度較高；⑦免疫印跡法（IBT），用于對酵母菌及真菌進行有效檢測，具有高分辨率、高敏感性及高特異性特點，主要步驟為：聚丙烯泰安凝膠電泳-電轉(zhuǎn)移-酶免疫定位。

3.2.3自動檢測法

自動檢測法是將酶聯(lián)免疫、固相吸附、乳膠凝集試驗及熒光檢測等方法融為一體的綜合性檢測系統(tǒng)，由美國麥道保健系統(tǒng)公司研制開發(fā)，其特點為樣品無需進行分離純化，可直接對其進行目標微生物種類及菌群檢測。

3.2.4抗阻測定法

將被檢測樣品分別接種于含有不同底物的培養(yǎng)基上，經(jīng)正確培養(yǎng)后利用抗阻測量儀對其微生物生長情況進行檢測，并根據(jù)其所表達的生長特征準確鑒定微生物種類?？棺铚y定法特點為敏感性、特異性、重復(fù)性較高，且獲得檢測結(jié)果所需時間較短，主要用于食物中霉菌、細菌、支原體、酵母菌等微生物的檢測工作。

3.2.5“即用膠”測定法

在無菌液體培養(yǎng)基中加入樣品并混勻，將所得混合物加入特殊培養(yǎng)皿（含膠質(zhì)），使膠質(zhì)與混合物接觸后形成復(fù)合物（與瓊脂類似），經(jīng)適宜條件培養(yǎng)后統(tǒng)計其菌種及數(shù)量。由于“即用膠”是一種產(chǎn)品，具有獨立包裝，使用時無需對其進行滅菌處理，適用于實驗室外環(huán)境中食品微生物的檢測。

微生物快速檢測法具有操作簡單方便、快速獲得結(jié)果、準確性較高、可重復(fù)性較強等優(yōu)點，在實際工作中用于食品微生物檢測效果顯著，有效保障食品安全，為提高人類生活質(zhì)量發(fā)揮重要作用。

4　結(jié)語

隨著科技的快速發(fā)展，相信在不久的將來，各種存在缺點的食品微生物檢測技術(shù)將會被新型、先進、簡便的微生物快速檢測技術(shù)所替代。通過對檢測技術(shù)與標準的不斷完善與規(guī)范，使其能在人類的公共衛(wèi)生、疾病預(yù)防、飲食健康等方面做出巨大的貢獻。

參考文獻

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·工藝技術(shù)·

LIANGHua- li*FANGYi
（Shanwei bureau ofentry- exit inspection and quarantine，Guangdong Shanwei 516600，China）

摘要綜述了食品微生物檢測技術(shù)的研究進展及其發(fā)展趨勢，分析了快速檢測法在食品微生物檢測中的應(yīng)用，為食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞食品；微生物；檢測技術(shù)；進展

AbstractThe research progress and development were reviewed and the quick detection method in food microorganismtestingwas discussed. The references were put forward for the development offood microorganismdetection technology.

Keywordsfood; microorganism; detection; development

收稿日期：2015- 02- 27

DOI：10.3969/j.issn.1673- 6044.2015.01.008

文章編號：1673- 6044（2015）01- 0022- 03

文獻標識碼：A

中圖分類號：TS207.4