秦麗娜(中山大學中山醫(yī)學院，廣州 510080)

·論著·

明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料的構(gòu)建及其生物相容性檢測

秦麗娜(中山大學中山醫(yī)學院，廣州 510080)

摘要：目的構(gòu)建明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料，并檢測其生物相容性。方法混合明膠、殼聚糖溶液后加入微量神經(jīng)營養(yǎng)素3，將混濁液注模成型后冷淋干燥制備明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料，利用掃描電子顯微鏡觀察支架材料形態(tài)，液體代替法測算孔隙率。提取明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料浸提液，觀察其對神經(jīng)干細胞活性的影響及對全反式維甲酸預誘導的神經(jīng)干細胞分化的影響，并采用膜片鉗技術(shù)檢測誘導分化前后細胞的電生理特性。結(jié)果明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料內(nèi)徑為(267.0±13.8)μm，孔隙率為90.0%。神經(jīng)干細胞在支架材料上生長良好，在全反式維甲酸誘導下形態(tài)向神經(jīng)元樣細胞改變，并初步表現(xiàn)出神經(jīng)元間突觸連接的結(jié)構(gòu)，且誘導分化的神經(jīng)元樣細胞初步具備神經(jīng)元細胞的電生理特性。結(jié)論成功構(gòu)建了明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料，其與神經(jīng)干細胞之間的生物相容性良好。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；支架材料；神經(jīng)營養(yǎng)素3；維甲酸；神經(jīng)干細胞

脊髓損傷常導致偏癱、截癱，其修復仍然是全球性醫(yī)學難題。在脊髓損傷的過程中，除機械損傷外，還包含局部微環(huán)境的損傷，主要包括細胞和組織的丟失、繼發(fā)的缺血缺氧、自由基生成等不利于修復的因素。研究人員以組織工程學為基礎(chǔ)，緊緊圍繞種子細胞、細胞因子、組織工程支架這3個要素[1]，進行了大量脊髓損傷修復的實驗研究，并取得了一些較好的效果[2,3]。本實驗采用明膠、殼聚糖為原料，并復合神經(jīng)營養(yǎng)素3，制備神經(jīng)支架，觀察其對全反式維甲酸預誘導的神經(jīng)干細胞分化的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料及制備明膠(生物級)、神經(jīng)營養(yǎng)素3試劑購自天津市科密歐化學試劑有限公司；殼聚糖(脫乙酰度95%)購自美國Sigma公司；冰醋酸、NaOH、碳酸鉀、NaCl均為市售分析純。人工腦脊液成分：2 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、125 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、2.5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2和25 mmol/L葡萄糖(pH 7.4)。電極內(nèi)液成分:120 mmol/L葡萄糖酸鉀、10 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA和20 mmol/L KCl(pH 7.2)。對于收集動作電位、自發(fā)興奮性突觸后電位的電極內(nèi)液成分:0.5 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、135 mmol/L葡萄糖酸鉀、5 mmol/L HEPES、5 mmol/L KCl、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L Na2ATP。灌流液成分:25 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L MgCl2、3.6 mmol/L KCl、117 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、1.2 mmol/L NaH2PO4和11 mmol/L葡萄糖(pH 7.4,利用NaOH調(diào)整)。

1.2明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料的構(gòu)建將明膠溶于去離子水，40 ℃水浴加熱，配成10%明膠溶液；將殼聚糖溶于2%的醋酸溶液中制備成2%的殼聚糖溶液。將明膠∶殼聚糖兩種溶液按質(zhì)量分數(shù)4∶6的比例混合[4]。然后再次放入40 ℃水浴中攪拌混勻，同時加入微量神經(jīng)營養(yǎng)素3，采用超聲分散，磁力攪拌法攪拌均勻，靜置24 h。將制備成功的懸濁液緩慢注入內(nèi)徑為250 μm、外徑為280 μm、長200 mm的硅膠套管中，鉛絲密封兩端。采用冷淋技術(shù)，將注模成功的樣品緩慢浸入深低溫冷淋劑(液氮)中，完全浸入液面后保留30～60 min，放入-80 ℃冰箱中保留30～60 min，使混懸液中沉淀物周圍形成連續(xù)、相互溝通的溶劑冰晶網(wǎng)架構(gòu)。將制備成功的200 mm長明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3懸濁液的硅膠管冷凍體，精確切成30 mm短節(jié)段，放置于預冷好的鋁彎盤中，置入Alphal-2型冷凍干燥機，在-60 ℃、100 mtorr下冷凍干燥24 h。支架中的溶劑冰晶升華后得到具有微孔結(jié)構(gòu)的支架架構(gòu)。真空狀態(tài)下升溫至0 ℃并維持6 h，繼續(xù)升溫至22 ℃維持30～60 min，解除真空后升至常溫，得到干燥成形的明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料。

1.3明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料形態(tài)觀察和孔隙率測量隨機抽取20根明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料，利用常規(guī)方法對神經(jīng)支架材料噴金鍍膜，采用掃描電子顯微鏡觀察支架材料的形態(tài)。采用目前較為常用的液體代替法測算孔隙率。使用75%乙醇溶液為替換液體，將神經(jīng)支架材料(干重W)放入可密封容器中，浸入乙醇(體積V1)，使用負壓抽吸支架材料內(nèi)氣體，直至無氣泡逸出。測量乙醇及乙醇—神經(jīng)支架總體積V2。緩慢取出支架，測量剩余乙醇(體積V3)。計算公式：孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。其中V1-V3為神經(jīng)支架中乙醇體積，V2-V3為神經(jīng)支架本身體積。

1.4明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料的生物相容性檢測①明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料浸提液的制備：取神經(jīng)支架材料100 mg置于20 mL離心管中，將其與3 mL細胞培養(yǎng)液混合，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱(100 r/min)24 h后，提取浸提液，加入α-MEM培養(yǎng)液，混合比例為1∶9，震蕩搖勻。全部過程需無菌操作。②神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)：參照既往培養(yǎng)神經(jīng)干細胞方法的實驗研究[5]，在無菌超凈臺下，選新生1～2 d純種SD乳鼠3只，取大腦皮質(zhì)，PBS反復沖洗后，將組織放入DMEM/F12混合液中浸泡漂洗。濾網(wǎng)取出組織塊后得到細胞懸液。調(diào)整細胞濃度為1×108個/mL，同時向DMEM/F12培養(yǎng)液中添加B27、表皮生長因子(EGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，三者濃度均為20 ng/mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后換液。7 d后將細胞移入離心管，100 r/min離心，5 min后，0.25%胰蛋白酶消化3 min，使用含N2的DMEM-F12細胞培養(yǎng)液吹打重懸后進行常規(guī)培養(yǎng)。每3 d換液1次，每7～10 d傳代1次。③神經(jīng)干細胞活性檢測：將第3代神經(jīng)干細胞以5×107/L的濃度移入24孔培養(yǎng)板，設(shè)實驗組和對照組，實驗組加支架材料浸提液0.2 mL，對照組加含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液0.2 mL，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d進行1次半量換液，培養(yǎng)14 d。采用MTT法檢測神經(jīng)干細胞活性[6,7]，通過酶聯(lián)免疫檢測儀，在570 nm波長的條件下，測定兩組細胞第1、5、10、14天的吸光度。④全反式維甲酸預誘導前后神經(jīng)干細胞形態(tài)觀察：將支架材料按照12孔培養(yǎng)板大小剪成圓片狀置于12孔培養(yǎng)板中，與濃度為1×107/L的第3代神經(jīng)干細胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)前，將EGF、bFGF從神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液中去除，同時移入全反式維甲酸和胎牛血清，維甲酸濃度為1 μmol/mL，胎牛血清體積分數(shù)為5%，培養(yǎng)14 d。觀察初始分離神經(jīng)干細胞、去除EGF、bFGF培養(yǎng)的細胞及支架材料浸提液與全反式維甲酸預誘導的神經(jīng)干細胞的細胞形態(tài)。⑤誘導分化前后神經(jīng)干細胞的電生理特性檢測：分別選取第3代誘導分化前神經(jīng)干細胞和④中經(jīng)全反式維甲酸誘導分化后的神經(jīng)干細胞。采用Sutter P-97水平拉制儀制作微電極。本實驗使用微電極尖端直徑為2.5～3.0 μm，阻抗為2～3 MΩ。采用倒置相差顯微鏡和液壓操縱儀進行顯微膜片鉗細胞操作。先將兩種待檢測的細胞用人工腦脊液灌流，在灌流前，利用95%O2/5%CO2混合氣體對人工腦脊液預先飽和1 h，然后使用電子刺激器產(chǎn)生脈沖電流，通過MEZ-8201微電極放大器向細胞內(nèi)注入恒定的脈沖電流，利用膜片鉗描筆記錄儀同時記錄靜息電位和膜電位。對待檢測細胞進行0.6～1.0 nA,310 ms的去極化電流胞內(nèi)注射，用來誘發(fā)動作電位；利用微電極將待測細胞膜電位鉗制于-70 mV，用來誘發(fā)并記錄細胞自發(fā)的興奮性突觸后電流。利用膜片鉗電位記錄儀器通過相關(guān)軟件收集處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料形態(tài)及孔隙率神經(jīng)支架材料呈長管狀，可根據(jù)需要自行調(diào)整長度，具有高度仿真性，神經(jīng)支架材料的橫切面上可見材料呈現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu)，縱切面上可見材料內(nèi)部呈軸向微管結(jié)構(gòu)，相鄰的微管之間未見孔隙相互連接(插頁Ⅰ圖1)，內(nèi)徑261～293(267.0±13.8)μm，孔隙率為84.1%～93.0%、平均90.0%。

2.2明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料的生物相容性初始分離神經(jīng)干細胞的形態(tài)多成圓球狀，培養(yǎng)2～3 d后，形成由多個細胞組成的細胞團，細胞團形態(tài)不規(guī)則，但細胞大小一致，細胞團折光性好。經(jīng)過傳代后，細胞團增大，且形態(tài)較為規(guī)則。對細胞進行去除EGF及bFGF的培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)，細胞貼壁生長，形態(tài)不一，出現(xiàn)多個突起。支架材料浸提液與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)14 d后，神經(jīng)干細胞出現(xiàn)類似神經(jīng)細胞的形態(tài)改變，胞體呈多角形以及不規(guī)則形，有多個突起，呈現(xiàn)出神經(jīng)元樣細胞的表現(xiàn)(插頁Ⅰ圖2)。實驗組、對照組第1天的吸光度值分別為0.29±0.06、0.30±0.04，第5天分別為0.39±0.09、0.40±0.03，第10天分別為0.69±0.05、0.58±0.06，第14天分別為0.87±0.07、0.64±0.07，兩組第10、14天時比較，P均<0.05。兩組細胞的吸光度值隨培養(yǎng)時間的延長而增大。支架材料浸提液與全反式維甲酸預誘導的神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)14 d后，支架材料的表面及空隙內(nèi)可見較多細胞生長，細胞胞體發(fā)出多個突起，胞體呈多角形以及不規(guī)則形，有多個突起，突起相互連接，使細胞交織成網(wǎng)狀，表現(xiàn)出類神經(jīng)元樣細胞的改變，支架材料對細胞無明顯生物學影響，在全反式維甲酸誘導下可促進神經(jīng)干細胞向類神經(jīng)元細胞分化，具有良好的細胞相容性。神經(jīng)干細胞誘導分化前、后靜息電位分別為(-28.99±5.08)、(-57.88±7.09)mV，膜電位分別為(18.09±1.09)、(36.80±5.03)pF，誘導分化前、后比較，P均<0.01。詳見圖1、2。

注：左上圖示誘導分化成神經(jīng)元樣細胞產(chǎn)生的動作電位；右上圖示神經(jīng)干細胞不產(chǎn)生動作電位；下圖示神經(jīng)元樣細胞鉗制在-40 mV時去極化,產(chǎn)生大量的動作電位。

圖1細胞的動作電位

注：a、b線示神經(jīng)干細胞無自發(fā)的興奮性突觸后電流；c、d線示誘導分化成神經(jīng)元樣細胞會產(chǎn)生自發(fā)的興奮性突觸后電流，但與正常的神經(jīng)元相比，其電流頻率低、幅度稍?。籩、f線示典型神經(jīng)元的自發(fā)的興奮性突觸后電流,電流頻率高、幅度大。

圖2膜片鉗記錄的細胞的興奮性突觸后電位

3討論

目前，脊髓損傷缺乏良好治療方法。中國每年有大量因事故導致的脊髓損傷患者，且以胸腰段脊髓損傷為主[6],組織工程學研究為解決這一問題提供了新思路。研究人員從工程支架材料入手，研究了一系列適合制作支架的材料[7,8]，如水凝膠、聚丙烯等。明膠和殼聚糖也是其中研究較為深入的兩種材料[9～10]，兩者來源廣泛，價格低廉，具有較好的生物相容性，殼聚糖可降解，還具有抗菌防腐和成膜性的特性。本實驗選用傳統(tǒng)的冷淋技術(shù)，將兩種材料的混合液處理后，制得的材料在掃描電鏡成像中顯示，材料的縱切面呈現(xiàn)長微管狀，微管之間彼此不相連，這為將來神經(jīng)元軸突以及突起相互連接提供了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且不易使神經(jīng)元橫向生長，抑制了瘢痕組織橫向愈合，提供了天然的結(jié)構(gòu)屏蔽作用。測量支架材料的孔隙率結(jié)果顯示，種子細胞可以大量“居住”在支架材料的天然空隙中，這為有效發(fā)揮種子細胞的修復作用提供了客觀的可能。此外，為有效修復損傷的脊髓，研究人員將神經(jīng)營養(yǎng)因子以及干細胞復合到支架材料上，使一個載體搭載多種修復機制，最大限度發(fā)揮組織工程材料的優(yōu)勢。其中神經(jīng)營養(yǎng)素3被發(fā)現(xiàn)具有較好的營養(yǎng)細胞、促進神經(jīng)元存活、維持其活性的作用，并可有效促使軸突延伸并再生[11]。此為支架材料有效發(fā)揮復合的神經(jīng)營養(yǎng)素3的作用，提供了可靠的實驗依據(jù)。

在干細胞研究方面，研究較多的有神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等[12～14],本實驗選用神經(jīng)干細胞，其在全反式維甲酸誘導下容易向神經(jīng)元樣細胞分化[15]。維甲酸具有較強的誘導性能，并在胚胎發(fā)育以及維持機體正常功能方面發(fā)揮重要作用[16]。本實驗按照既往的實驗方法獲得神經(jīng)干細胞，并在全反式維甲酸的誘導下與支架材料浸提液及共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，支架材料本身對神經(jīng)干細胞無生物學影響，且隨著時間的推移，能夠有效維持并加強干細胞的活性；在維甲酸的誘導下，神經(jīng)干細胞能夠向神經(jīng)元樣細胞分化，并分別從細胞形態(tài)以及細胞電生理特性得到證實。在細胞形態(tài)上，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過誘導分化后的神經(jīng)干細胞具有類神經(jīng)元的形態(tài)改變。電生理檢測中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞和經(jīng)過全反式維甲酸誘導分化后的神經(jīng)元樣細胞，兩者的膜電位和靜息電位出現(xiàn)顯著差別，后者更加接近成熟的神經(jīng)元細胞的電生理特征[17]，與既往其他研究結(jié)果一致，從電生理方面證實了本實驗誘導分化的有效性。神經(jīng)元樣細胞被誘導出動作電位,而未誘導分化的神經(jīng)干細胞不能誘發(fā)動作電位,這進一步證實了神經(jīng)元樣細胞具有與神經(jīng)元類似的活性。此外，神經(jīng)元樣細胞上發(fā)現(xiàn)自發(fā)的興奮性突觸后電位，與成熟的神經(jīng)元表現(xiàn)相似，但兩者頻率和幅度有一定的差別。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了明膠—殼聚糖復合神經(jīng)營養(yǎng)素3神經(jīng)支架材料，其與神經(jīng)干細胞之間的生物相容性良好，這為未來利用組織工程復合神經(jīng)營養(yǎng)因子、種子細胞，進而治療脊髓損傷奠定了較好的基礎(chǔ)。

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Establishment of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold and its biocompatibility

QINLi-na

(ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Abstract:ObjectiveTo fabricate the gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffolds and to determine its biocompatibility. MethodsWe mixed the gelatin and chitosan solutions, then added a trace of neurotrophin-3. After making the injection mold, we fabricated the nerve guidance scaffolds by the freeze-drying technique. Then the characteristics of the scaffold were observed by scanning electron microscope morphology, and the scaffold diameter, porosity, etc were detected. We extracted the gelatin chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffold material extracts, and then we observed the effects on the growth and differentiation of neural stem cells; the electrophysiological properties of the differentiated cells were observed by the patch-clamp technique. ResultsThe inside diameter of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold was (267.0±13.8) μm and porosity was 90.0%. Scanning electron microscopy showed that neural stem cells grew well on the scaffold. Under the induction of retinoic acid, neural stem cells differentiated into neuron-like cells, and showed structural of synaptic connections between neurons initially. What′s more, the cells differentiated were detected the neuron-like cell electrophysiological properties by the patch-clamp technique. Conclusion The gelatin-chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffolds were successfully constructed, and had good biocompatibility with neural stem cells.

Key words:spinal cord injuries; scaffold materials; neurotrophin-3; retinoic acid; neural stem cells

(收稿日期：2014-11-12)

作者簡介：秦麗娜(1978-)，女，博士，講師，主要研究方向為干細胞治療神經(jīng)損傷。E-mail:qinglina20088@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31200737)；廣東省醫(yī)學科研基金立項課題(B2012080)。

中圖分類號：R318

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.001