劉達(dá)玉 王慧超 鄭林用 戴玄 李宗堂 陳今朝

摘要：對(duì)武陵山羊肚菌（Morchella ?esculenta）的液體培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最適液體培養(yǎng)條件為pH 6.0、培養(yǎng)液裝量100 mL/250 mL、接種量8%、溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間6 d;最適發(fā)酵培養(yǎng)基為4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4和0.10% MgSO4·7H2O。在此條件下，菌絲體干重為6.880 g/L，胞外多糖產(chǎn)量為0.861 g/L。

關(guān)鍵詞：武陵山羊肚菌（Morchella ?esculenta）;液體培養(yǎng);菌絲體;胞外多糖

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.32 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0405-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.037

Optimizing of Liquid Culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain

LIU Da-yu1，WANG Hui-chao2，ZHENG Lin-yong3，DAI Xuan2，LI Zong-tang4，CHEN Jin-zhao2

（1.Faculty of Biotechnology Industry，Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.Life Science and Technology Institute， Yangtze Normal University， Chongqing 408100，China; 3.Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066，China;

4.Chengdu Rongzhen Edible Fungi Ltd.， Chengdu 611733，China）

Abstract： The conditions and media of liqiud culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain were optimized. The results showed that the optimal conditions were the pH value of 6.0， the medium capacity of 100 ml/250 ml triangle bottle， the inoculation quantity of 8.0%， the temperature of 25 ℃， the rotation speed of shaking flask of 180 r/min and the time of 6 days. The optimal liquid fermentation media of Morchella esculenta were 4.0% sucrose，0.70% yeast powder，0.15% KH2PO4 and 0.10% MgSO4·7H2O. Under these conditions， the dry weight of the mycelia and the yield of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta were up to 6.880 g/L and 0.861 g/L， respectively.

Key words： Morchella esculenta in Wuling Mountain; liquid culture; mycelium; extracellular polysaccharide

羊肚菌（Morchella esculenta）是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、美味可口的珍貴食藥用菌，其性平、味甘，益腸胃、化痰理氣，補(bǔ)腎、壯陽(yáng)，補(bǔ)腦、提神，具有增強(qiáng)肌體免疫力、抗疲勞、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制腫瘤等功能[1，2]。雖然國(guó)內(nèi)外已有一些羊肚菌人工栽培的報(bào)道，但由于其對(duì)氣候、土壤等環(huán)境條件要求苛刻，至今仍未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；耘郲3-6]。自然資源很少，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。為此，筆者分離重慶武陵山羊肚菌，并對(duì)其液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，擬為其人工栽培、食品和藥品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菌種：武陵山羊肚菌，長(zhǎng)江師范學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

母種PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯（去皮）煮汁，2.0%葡萄糖，0.30%蛋白胨，1.8%瓊脂，0.10% K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH自然[7]。

液體種子培養(yǎng)基：10%馬鈴薯煮汁，2.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4，pH 6.0[8]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：4.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH 6.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種活化 ?把保藏的羊肚菌母種轉(zhuǎn)接到無(wú)菌PDA培養(yǎng)基平皿上，25 ℃培養(yǎng)7 d，備用。

1.2.2 ?液體培養(yǎng)方法 ?將種子培養(yǎng)液裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，0.10 MPa、121.3 ℃滅菌20 min，冷卻，接羊肚菌母種于錐形瓶中，160 r/min、25 ℃培養(yǎng)3 d備用[9]。發(fā)酵培養(yǎng)液裝量同種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)時(shí)間6 d。

1.2.3 ?發(fā)酵培養(yǎng)基選擇 ?選取蔗糖、酵母粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O 4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。通過(guò)試驗(yàn)，篩選最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.4 ?菌絲體干重測(cè)定 ?取發(fā)酵液30 mL，在4 000 r/min離心10 min，沉淀菌絲體用去離子水洗滌3次，于70 ℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 ?羊肚菌胞外多糖測(cè)定 ?參照武秋立等[10]的方法，取出菌絲體羊肚菌發(fā)酵液加入3倍乙醇于0 ℃下沉淀12 h，于4 000 r/min離心10 min;棄上清液，沉淀加少量乙醇再離心，重復(fù)兩次后，將沉淀用去離子水溶解定容，用硫酸-蒽酮法于620 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)硫酸-蒽酮葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.6 ?數(shù)據(jù)處理 ?試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS 7.05版軟件處理，用LSD法比較菌絲體干重和多糖的差異顯著性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?液體培養(yǎng)條件選擇

2.1.1 ?pH對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?用2.0 mol/L HCl或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，接種培養(yǎng)（表2）。當(dāng)pH 6.0時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)最快，其干重和胞外多糖產(chǎn)量均最高; pH 6.0與pH 7.0菌絲體干重之間差異不顯著，而pH 6.0與pH 5.0胞外多糖產(chǎn)量之間差異極顯著;當(dāng)pH 4.0時(shí)，菌絲體干重及多糖產(chǎn)量均最低?？梢?jiàn)，菌絲體生長(zhǎng)、多糖形成的最適pH為6.0。

2.1.2 ?培養(yǎng)液裝量對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?250 mL三角瓶分別裝60、80、100、120、140 mL培養(yǎng)液（表3）。當(dāng)培養(yǎng)液裝量為100 mL時(shí)，菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最高;當(dāng)裝量為140 mL時(shí)菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最低。因此，最適裝量為100 mL。

2.1.3 ?接種量對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?培養(yǎng)液接種量分別為4%、8%、12%、16%、20%（表4）。當(dāng)接種量8%時(shí)，菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最高;接種量8%與12%菌絲體干重、多糖產(chǎn)量之間均差異極顯著;接種量20%時(shí)，菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最低?？梢?jiàn)，最適接種量是8%。

2.1.4 ?溫度對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?培養(yǎng)溫度分別為21、23、25、27、29 ℃（表5）。在25 ℃時(shí)，菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最高;在21℃時(shí)，菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最低?？梢?jiàn)，最適培養(yǎng)溫度是25 ℃。

2.1.5 ?轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?將培養(yǎng)液置于搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為140、160、180、200、220 r/min（表6）。當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌絲體干重最重，180、200 r/min菌絲體干重之間差異顯著;當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，多糖產(chǎn)量最高;而200、180 r/min多糖產(chǎn)量之間差異不顯著。因此，最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.1.6 ?培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?培養(yǎng)液分別培養(yǎng)4、5、6、7、8 d（表7）。當(dāng)培養(yǎng)6 d時(shí)菌絲體干重最重，培養(yǎng)6 d與7 d菌絲體干重之間差異極顯著;培養(yǎng)8 d時(shí)多糖產(chǎn)量最高，培養(yǎng)8 d與7 d多糖產(chǎn)量之間差異不顯著，而培養(yǎng)7 d與6 d多糖產(chǎn)量之間有極顯著差異。因此，最適培養(yǎng)時(shí)間為6 d。

2.2 ?發(fā)酵培養(yǎng)基選擇

2.2.1 ?碳源對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?分別用4.0%可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和麥芽糖代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源（表8）。結(jié)果菌絲體干重在蔗糖培養(yǎng)基中最重，在可溶性淀粉培養(yǎng)基中最輕;多糖產(chǎn)量在可溶性淀粉培養(yǎng)基中最高，在麥芽糖培養(yǎng)基中最低。綜合菌絲體干重和多糖產(chǎn)量，選蔗糖為最適碳源。

2.2.2 ?氮源對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?分別用0.50%牛肉膏、酵母粉、硫酸銨和尿素代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨（表9）。菌絲體干重、多糖產(chǎn)量在酵母粉培養(yǎng)基中均最高，二者在尿素培養(yǎng)基中均最低。因此，酵母粉是最適氮源。

2.2.3 ?無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體干重和多糖產(chǎn)量的影響 ?分別用0.10% K2HPO4、CaSO4·0.5H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的K2HPO4和MgSO4·7H2O（表10）。在只有K2HPO4培養(yǎng)基中菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最高，但在K2HPO4與MgSO4·7H2O培養(yǎng)基中菌絲體干重、多糖產(chǎn)量之間差異不顯著;在ZnSO4·7H2O培養(yǎng)基中菌絲體干重、多糖產(chǎn)量均最低。因此，最適無(wú)機(jī)鹽是K2HPO4。

2.2.4 ?正交試驗(yàn)結(jié)果 ?由表11可知，以菌絲體為指標(biāo)的培養(yǎng)基最優(yōu)配方為A2B3C3D2;以多糖為指標(biāo)的培養(yǎng)基最優(yōu)配方為A2C3D3B2;兩者結(jié)合并合并主次順序選A2B3C3D2，即4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。但該培養(yǎng)基配方不在正交試驗(yàn)列表中，用該培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果菌絲體干重為6.880 g/L，胞外多糖為0.861 g/L。

3 ?小結(jié)

武陵山羊肚菌的最適液體培養(yǎng)條件為pH 6.0、250 mL錐形瓶培養(yǎng)液裝量為100 mL、接種量8%、溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間6 d。最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基為4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。在此優(yōu)化條件下，菌絲體干重為6.880 g/L，多糖產(chǎn)量為0.861 g/L，菌絲體干重、胞外多糖產(chǎn)量分別比正交試驗(yàn)表中的最優(yōu)配方A2B3C1D2高9.71%和19.09%。

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