徐兵，張雅君，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

黑皮雞樅菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化

徐兵，張雅君，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

以黑皮雞樅菌深層液體發(fā)酵菌絲體生物量為指標(biāo)，首先通過單因素試驗(yàn)確定了最佳的培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、pH值、發(fā)酵周期，然后經(jīng)過響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度為26℃，搖床轉(zhuǎn)速為175 r/min，pH值為7.6，發(fā)酵周期為25 d.通過驗(yàn)證培養(yǎng)后，黑皮雞樅菌絲體干重達(dá)6.91 mg/mL.

黑皮雞樅；深層發(fā)酵；優(yōu)化

黑皮雞樅菌（termitomyces albuminosus）是屬擔(dān)子亞門菌，層菌綱，傘菌目，口蘑科［1-4］.其肉質(zhì)鮮嫩，口感獨(dú)特，作為食品藥品皆可，備受人們青睞.黑皮雞樅菌是科研人員歷經(jīng)數(shù)年研究［5］，于2006年選育出能人工栽培的珍稀食用菌，胡尚勤［6］、曾先福［7］等對雞樅菌的生長條件有研究，羅曉妙［8］對于雞樅菌菌絲體的液體培養(yǎng)進(jìn)行了條件優(yōu)化，薛林浩［1］等對雞樅菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，但目前對于黑皮雞樅菌絲體液體發(fā)酵條件的優(yōu)化尚未見報道.本文針對黑皮雞樅菌株深層發(fā)酵條件優(yōu)化展開研究，旨在為實(shí)現(xiàn)黑皮雞樅菌擴(kuò)大化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和設(shè)備

黑皮雞樅：常熟理工學(xué)院食用菌發(fā)酵工程技術(shù)研究中心種植.

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱303A-3S型：浦東榮豐科學(xué)儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-GF101-AO-S型：南京百思威科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-75KBS（內(nèi)循環(huán)）型：南京菲奇工貿(mào)有限公司；電子天平M124A型：南京菲奇工貿(mào)有限公司；潔凈工作臺SW-CJ-2F型：蘇州凈化公司；震蕩培養(yǎng)箱ZQWY-200G型：上海知楚儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，瓊脂20 g，pH自然.

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，VB10.002 g，pH自然.

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，VB10.002 g，VB60.006 g，將發(fā)酵培養(yǎng)基配好后，用0.5 mol/L的NaOH和HCL調(diào)節(jié)pH至指定pH值.

1.2.2 液體培養(yǎng)

先對黑皮雞樅進(jìn)行組織分離，做成母種，再將母鐘接種到種子培養(yǎng)基，在震蕩培養(yǎng)箱中靜置48 h后，震蕩培養(yǎng)，25 d后按10%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在震蕩培養(yǎng)箱中靜置48 h后，按實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，得到的菌絲體用60目刪網(wǎng)過濾，用電熱鼓風(fēng)干燥箱于60℃烘干至恒重，計算菌絲體干重.

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1）溫度的影響.以菌絲體干重作為指標(biāo)，在搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時間為30 d，pH值為7的條件下，將溫度分別設(shè)為21，24，27，30，33℃5個不同的梯度，考察不同溫度對黑皮雞樅發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響.

（2）搖床轉(zhuǎn)速的影響.以菌絲體干重作為指標(biāo)，在溫度為27℃，培養(yǎng)時間為30 d，pH值為7的條件下，將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為120，140，160，180，200 r/min 5個不同的梯度，考察不同搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響.

（3）發(fā)酵周期的影響.以菌絲體干重作為指標(biāo)，在培養(yǎng)溫度為27℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，pH值為7的條件下，將發(fā)酵周期分別設(shè)定為15，20，25，30，35 d 5個不同的梯度，考察不同發(fā)酵周期對黑皮雞樅發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響.

（4）PH值的影響.以菌絲體干重作為指標(biāo)，在溫度27℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時間30 d的條件下，將pH值調(diào)至5，6，7，8，9 5個不同的梯度，考察不同初始pH值對黑皮雞樅發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響. 1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

對影響黑皮雞樅液體發(fā)酵的關(guān)鍵因素（溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期、PH值）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，采用Box-Behnken模型進(jìn)行設(shè)計，采用Design Expert 8.05 b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度的影響

由圖1可知，黑皮雞樅菌絲體干重剛開始隨著溫度上升，菌絲體干重也相應(yīng)提高，但當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到27℃后，黑皮雞樅菌絲體干重逐漸下降，因此，選擇27℃作為最佳的發(fā)酵溫度，當(dāng)前菌絲體干重為5.42 mg/mL.

圖1 溫度對黑皮雞樅菌絲體的影響

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體的影響

表1 編碼與因子實(shí)際濃度的對應(yīng)關(guān)系

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速的影響

由圖2可知，黑皮雞樅菌絲體干重剛開始隨著搖床轉(zhuǎn)速上升，菌絲體干重也相應(yīng)提高，但當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min后，黑皮雞樅菌絲體干重逐漸下降，因此，選擇160 r/min為最佳的搖床轉(zhuǎn)速.

2.2.3 發(fā)酵周期的影響

由圖3可知，從發(fā)酵開始到第25天，菌絲生長進(jìn)入了對數(shù)生長期，發(fā)酵第25天，菌絲體產(chǎn)量最大，之后菌絲體產(chǎn)量開始下降，因此選擇25 d作為最佳的發(fā)酵周期.

2.2.4 pH值的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為7時，黑皮雞樅菌絲體干重最大.當(dāng)pH值高于7時，菌絲體產(chǎn)量下降，因此，選擇7作為最佳pH值.

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

按照Design Expert 8.05 b軟件中的Box-Behnken Design方法，經(jīng)擬合后得到的回歸方程為：菌絲體干重=5.84+0.059 A+1.5 B-0.40 C－0.37 D+0.065 AB+0.48 AC－1.24 AD－0.13 BC+0.6 BD－0.028 CD－0.91 A2－1.12 B2+0.04 C2－1.14 D2

對該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.結(jié)果表明，該模型極顯著（P=0.0001< 0.01）.R2=0.9537，說明模型與試驗(yàn)擬合較好，可用于設(shè)計范圍內(nèi)的預(yù)測.

圖3 發(fā)酵周期對黑皮雞樅菌絲體的影響

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

由表3可知，在一次項(xiàng)中，搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體干重的影響極顯著（P＜0.0001），發(fā)酵周期對黑皮雞樅菌絲體干重的影響顯著（P=0.0071），pH值對黑皮雞樅菌絲體干重的影響顯著（P=0.0111），而溫度對菌絲體干重的影響為不顯著.在二次項(xiàng)中，溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期的影響都達(dá)到了極顯著水平.交互項(xiàng)中，溫度和pH值的交互作用極顯著，其他各因素的交互作用都不顯著.

接表2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

根據(jù)Design Expert 8.05 b軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖8～圖10所示，以此確定出各個因素的最佳水平.

圖5 溫度及搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的響應(yīng)面圖

圖6 溫度及搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的等高線圖

圖7 pH值及搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的響應(yīng)面圖

圖8 pH值及搖床轉(zhuǎn)速對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的等高線圖

圖9 pH值及溫度對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的響應(yīng)面圖

圖10 pH值及溫度對黑皮雞樅菌絲體干重交互作用的等高線圖

通過分析預(yù)測得到黑皮雞樅菌絲體干重最大值為6.96 mg/mL，即當(dāng)A（溫度）=25.62℃，B（搖床轉(zhuǎn)速）= 175.73 r/min，C（發(fā)酵周期）=25.00 d，D（pH）=7.62.考慮到實(shí)際操作方便，最終確定發(fā)酵條件的組合為：溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速175 r/min，發(fā)酵周期25 d，pH 7.6.用以上得到的最優(yōu)配方重復(fù)試驗(yàn)3次，3次試驗(yàn)菌絲體干重平均值為6.91 mg/mL，與預(yù)測值差別不大，由此可以看出，預(yù)測出的回歸方程為黑皮雞樅菌絲體液體發(fā)酵提供了一個合適的模型.優(yōu)化后黑皮雞樅菌絲體產(chǎn)量提高，為進(jìn)一步的放大實(shí)驗(yàn)提供了理論參考.

3 結(jié)論

由單因素試驗(yàn)可知，試驗(yàn)菌株液體發(fā)酵最佳溫度為26℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，發(fā)酵周期為25 d，pH值為7.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速175 r/min，發(fā)酵周期25 d，pH值為7.6.在此條件下發(fā)酵后，黑皮雞樅菌絲體干重達(dá)6.91 mg/mL，比優(yōu)化前提高了35%.本試驗(yàn)首次對黑皮雞樅菌絲體深層液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，為黑皮雞樅菌的進(jìn)一步擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了參考.

［1］薛林浩，王曉東，蔡虹，等.黑皮雞樅菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報，2013，28（10）：24-27.

［2］鄒盛勤，陳武.食用菌的營養(yǎng)成分·藥理作用及開發(fā)利用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（3）：502-503.

［3］卯曉嵐.中國大型真菌［M］.鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000：142-143.

［4］付子艷，李榮春.雞樅菌屬關(guān)系的初步研究［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，38（3）：271-274.

［5］孫思國.一種黑皮雞樅菌生產(chǎn)方法：200710115866［P］.2007-12-26.

［6］胡尚勤，劉天貴，李賢柏.雞樅菌的培養(yǎng)條件研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，27（1）：67-70.

［7］曾先富，陳陽婷，熊維全，等.雞樅菌菌絲體培養(yǎng)試驗(yàn)［J］.食用菌，2012，34（6）：9-10，18.

［8］羅曉妙.液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)雞樅菌菌絲體的條件優(yōu)化［J］.食品科技，2010，35（3）：29-33.

Predominant Strains Breeding and Optimization of Submerged Liquid Fermentation Conditions of Termitomyces Albuminosus

XU Bing,ZHANG Yajun,JI Hong
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Termitomyces albuminosus was studied in this paper.Its mycelium biomass was taken as indexes through submerged liquid fermentation.First,the best culture temperature,shaking speed,pH and fermentation period were identified through the single factor experiment.Then,the optimum fermentation conditions were obtained through the response surface experiments:the optimum temperature was 26℃,the shaker speed was 175 r/min and pH was 7.6,the fermentation period was 25 days.Under the above conditions,the dry weight of agaric mycelium reached 6.91 mg/mL.

Termitomyces albuminosus;submerged fermentation;optimization

Q949.32

A

1008-2794（2017）02-0104-05

2016-05-17

常熟理工學(xué)院青年基金項(xiàng)目“黑皮雞樅液體菌種的制備及發(fā)酵條件的優(yōu)化”（QZ1504），常熟理工學(xué)院重點(diǎn)畢業(yè)論文“黑皮雞樅菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化”（1655LG）

冀宏，教授，博士，研究方向：食、藥用菌工程技術(shù)研究及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理，E-mail：jihong@cslg.cn.