豆宏瑤，高慧娟，黃金梅，楊國紅，徐建梅

（河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，甘肅張掖734000）

豬苓菌絲體發(fā)酵條件的優(yōu)化

豆宏瑤，高慧娟*，黃金梅，楊國紅，徐建梅

（河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，甘肅張掖734000）

以菌絲體干重為評價指標，研究不同發(fā)酵條件對豬苓菌絲體干重的影響。試驗采用了液體搖瓶培養(yǎng)的方法，在不同的溫度、pH、裝液量和培養(yǎng)時間的條件下，測定豬苓菌絲體干重的，確定各單因素條件下豬苓菌絲體的最佳發(fā)酵條件，再采用L9（34）正交試驗設(shè)計優(yōu)化菌絲體發(fā)酵條件。結(jié)果表明，當溫度為25℃、裝液量為100 mL/250 mL、pH為5.5、培養(yǎng)時間11 d時，為菌絲體最優(yōu)發(fā)酵條件，進一步在此條件下進行驗證性試驗得菌絲體干重為1.023 g/100 mL，說明通過優(yōu)化發(fā)酵條件，可以有效提高豬苓菌絲體干重量。

豬苓；菌絲體：液態(tài)發(fā)酵；正交試驗

豬苓Polyporus umbellate（Pers.）Fries屬真菌門，多孔菌科，豬苓（地花）屬，別名野豬糞［1］。豬苓作為常用中藥，在我國已有2000多年的入藥歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，豬苓具有利尿、抗腫瘤、保護肝臟、增強免疫力、抗輻射等作用［2-3］。除多糖外，甾體類為其主要化學成分，生物活性多樣，幾乎無毒副作用，在臨床上具有廣泛用途和良好療效，是一種很具開發(fā)潛力的常用中藥［4］。

近年來豬苓的藥用價值越來越受到人們的重視［5］。由于豬苓以野生為主，野生產(chǎn)量日漸匱乏，人工栽培的時間短，產(chǎn)量低，引種產(chǎn)量少，致使豬苓的上市量呈逐年下滑之勢，豬苓的人工栽培也面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)，而采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)菌絲體，培養(yǎng)過程容易控制，且成本低，可以獲得大量菌絲體［6］，而豬苓菌絲體量受環(huán)境條件的影響較大［7］，本研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化菌絲體發(fā)酵條件，為大批量生產(chǎn)豬苓菌絲體提供一定的參考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1儀器

HZQ-X400型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；CL-32L型高壓滅菌鍋：ALP公司；5A2003型精密電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；pH分析測量儀：上海盛磁儀器有限公司；SKJH-2112型超凈工作臺。

1.1.2菌株

豬苓：河西學院應(yīng)用真菌工程實驗室提供。

1.1.3化學試劑

95%乙醇，葡萄糖，瓊脂，NaOH，HCl均為分析純。

1.1.4培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL。

1.2方法

1.2.1PDA培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2 cm2的小塊，放入水中煮沸30 min，用玻璃棒攪拌以防糊底，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加入葡萄糖2%，瓊脂2%，加自來水定量至1 000 mL，pH為自然。

1.2.2菌種活化

將保存于4℃冰箱中的豬苓種菌塊接入新鮮的固體斜面培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8天后，再轉(zhuǎn)接一次，28℃培養(yǎng)待菌絲長滿斜面時，置于4℃冰箱備用。

1.2.3發(fā)酵條件對菌絲體干重的影響

1.2.3.1溫度對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入100 mL的PDA培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。置于130 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器上，分別在22、25、28、31、34℃的條件下進行培養(yǎng)，每個溫度梯度設(shè)3個平行。8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.2裝液量對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，分別加入50、75、100、125、150 mL的PDA培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6mm的菌絲塊。每個裝液量梯度設(shè)3個平行，采用1.2.3.1的最佳發(fā)酵溫度置于130 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器上進行培養(yǎng)。8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發(fā)酵裝液量。

1.2.3.3pH對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳裝液量的培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。設(shè)置pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 5個梯度，每個梯度設(shè)3個平行。以1.2.3.1的最佳發(fā)酵溫度，置于130 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器上進行培養(yǎng)，8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發(fā)酵初始pH。

1.2.3.4發(fā)酵時間對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳裝液量的培養(yǎng)基，將pH調(diào)至1.2.3.3的最佳pH，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。以1.2.3.1的最佳發(fā)酵溫度置于130 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器上培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別設(shè)定為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，同一培養(yǎng)時間設(shè)定3個平行。測定菌絲體干重，以確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.4菌絲體干重的測定

搖床培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液過濾，蒸餾水反復洗滌菌球后，置于55℃烘箱中烘干至恒重，稱重得到菌絲體干重。

1.2.5豬苓菌絲體發(fā)酵條件正交試驗的設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗，以發(fā)酵的溫度、裝液量、pH和培養(yǎng)時間為考察因素進行優(yōu)化發(fā)酵條件的設(shè)計，每因素選取3個水平，設(shè)計因素水平見表1。

表1　豬苓菌絲體發(fā)酵條件的正交試驗設(shè)計Table 1Fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellate by orthogonal experimental design

2結(jié)果與分析

2.1溫度對豬苓菌絲體生長量的影響

培養(yǎng)溫度22℃～32℃范圍內(nèi)豬苓菌絲體均能生長，在22℃～25℃內(nèi)菌絲體量變化不大，在25℃～28℃內(nèi)菌絲體量呈明顯增長趨勢，28℃菌絲體含干重達最大值，28℃后又呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)果見圖1。

圖1　溫度對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.1Effect of Temperature on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖1可知菌絲體量隨溫度的上升而下降，這可能是高溫引起某些酶失活進而影響了菌絲體的生長，低溫會影響物質(zhì)的溶解性，物質(zhì)只有溶于水才能被菌絲體吸收，物質(zhì)的溶解度隨溫度變化而變化，最終影響菌絲體生長，低溫也會影響細胞質(zhì)膜的流動性［8］，溫度的變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。由此得到豬苓菌絲體的最佳發(fā)酵溫度為28℃。

2.2裝液量對豬苓菌絲體的生長量的影響

在豬苓液體發(fā)酵過程中，豬苓菌絲體干重量呈弓形趨勢變化，裝液量為50 mL～100 mL時，菌絲體量隨裝液量的增加而不斷上升；裝液量為100 mL時，豬苓菌絲體干重達最大值；裝液量為100 mL～150 mL時，菌絲體量隨裝液量的增加而不斷減少，結(jié)果見圖2。

圖2　裝液量對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.2Effect of fluid volume on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖2可知，說明裝液量少，發(fā)酵液中氧氣的交換率較強，有足夠的空間提供氧氣量，菌絲體生長旺盛；裝液量多，氧氣交換率較弱，供氧空間越來越?。?］，越不利于豬苓菌絲體的生長。由此得到豬苓菌絲體發(fā)酵的最佳裝液量為100 mL。

2.3pH對豬苓菌絲體生長量的影響

豬苓菌絲體量在初始pH3.5～pH4.5之間呈上升趨勢，在pH4.5時菌絲體干重達到最大值，pH4.5以后菌絲體量又呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)果見圖3。

圖3　發(fā)酵pH對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.3Effect of pH on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖3可知，初始pH太大或太小均不利于胞外多糖的形成，一般認為，微生物機體內(nèi)的絕大多數(shù)反應(yīng)是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都有一個最適pH，低于或高出這個范圍，其生長就會受到抑制，并且環(huán)境中的酸堿度也會影響到菌絲體細胞膜的滲透性以及膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性。豬苓菌絲體發(fā)酵的最適pH為4.5，這與真菌一般偏酸性環(huán)境生長，最適pH多為4.0～6.0相一致。由此得到豬苓菌的最適發(fā)酵pH為4.5。

2.4培養(yǎng)時間對豬苓菌絲體生長量的影響

菌絲體量隨著培養(yǎng)時間的增加不斷增大，6天之前菌絲體量少且變化不大，6 d～9 d菌絲體量呈上升趨勢且顯著增多，培養(yǎng)到10天時菌絲體干重達到最大值，10天后菌絲體量略呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)果見圖4。

圖4　培養(yǎng)時間對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.4Effect of Culture time fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖4可知，分析記錄菌絲體的生長狀況，菌絲體在培養(yǎng)7天后其生長速度加快，菌絲潔白、生長旺盛，在培養(yǎng)11天后，菌絲體逐漸變成灰白色［10］，生長速度也變得緩慢，意味著菌絲體生長速度減緩，開始老化現(xiàn)象。由此得到豬苓菌的最適培養(yǎng)時間為10 d。

2.5正交試驗結(jié)果分析

由表2可知，各因素的極差不相等，因素C的極差最大，因素D的極差的最小，這說明各因素水平改變對試驗結(jié)果的影響是不相同的，極差越大，表示該列因素的數(shù)值在試驗范圍內(nèi)的變化，將導致試驗指標在數(shù)值上具有更大的變化［11］。通過正交試驗極差分析法獲得優(yōu)化方案A1B2C3D3，即在溫度25℃下加入pH 5.5的PDA培養(yǎng)基100 mL/250 mL置于液體搖床發(fā)酵11 d測得菌絲體干重為1.023 g/100 mL。對比正交試驗9個方案中的5號方案A2B2C3D1，發(fā)現(xiàn)其與優(yōu)化方案的發(fā)酵條件非常相似，但菌絲體含量遠不及驗證試驗的菌絲體含量。優(yōu)化方案并不包含在正交表中已做過的9個試驗方案中，這正體現(xiàn)了正交設(shè)計表的優(yōu)越性。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2The result of orthogonal experimental

對正交試驗進行方差分析，結(jié)果顯示，初始pH和裝液量對結(jié)果的影響極顯著，溫度對結(jié)果的影響顯著，時間對結(jié)果的影響差異不顯著，結(jié)果見表3。

表3　正交試驗的方差分析表Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

因此確定液體發(fā)酵豬苓的最佳條件為溫度25℃，裝液量100 mL，pH5.5，培養(yǎng)時間11 d。

3結(jié)論

不同單因素對菌絲體干重的影響不同，經(jīng)過單因素試驗得到溫度為28℃時，菌絲體干重達最大值0.435 g/100 mL；裝液量為100 mL時，菌絲體干重達最大值0.639 g/100 mL；pH為4.5時，菌絲體干重達最大值0.639 g/100 mL；培養(yǎng)時間為10 d時，菌絲體干重達最大值0.479 g/100 mL。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗優(yōu)化最佳發(fā)酵條件為：溫度25℃、pH5.5、裝液量100 mL及發(fā)酵11 d，通過驗證試驗測得菌絲體干重為1.023 g/100 mL，對比正交試驗方案中最高值0.908 g/100 mL增加了12.6%，說明優(yōu)化豬苓菌絲體發(fā)酵條件能夠有效的提高菌絲體量。

［1］許廣波，傅偉杰，趙旭奎.我國豬苓研究的進展［J］.菌物研究，2003，1（1）:58-61

［2］楊明，王曉娟，孫紅，等.樹舌多糖抗?jié)冏饔茫跩］.中藥藥理與臨床，2009，20（6）:11-13

［3］周鍵，孫培龍，趙培城，等.食用菌深層發(fā)酵的研究進展［J］.微生物學通報，2003，30（6）:111-114

［4］趙英永，崔秀明，張文斌，等.豬苓的化學成分與藥理作用研究進展［J］.中草藥，2009，32（11）:1785-1787

［5］劉洪超，楊小龍，王淑英.豬苓藥理作用研究進展［J］.河南科技大學學報（醫(yī)學版），2011，29（2）:159-161

［6］高慧娟，楊霞霞，杜學基.荷葉離褶傘菌絲體富硒條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，31（5）:35

［7］邢詠梅，郭順星.環(huán)境因子對豬苓菌絲體生長發(fā)育的影響［J］.中國藥學雜志，2011，30（7）:35-38

［8］沈萍，陳向東.微生物學［M］.北京:高等教育出版社，2008:125-126

［9］劉德華，劉宏娟，程可可.微生物好氧發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法［J］.合成纖維，2006，12（8）:37-38

［10］宋淑敏，王大鵬，李新華，等.深層發(fā)酵靈芝生物工程技術(shù)與產(chǎn)品研究［J］.食品科學，1999，33（12）:40-43

［11］李云雁，胡傳榮.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2008:130-131

Optimization of Fermentation Conditions for Mycelium of Polyporus umbellate

DOU Hong-yao，GAO Hui-juan*，HUANG Jin-mei，YANG Guo-hong，XU Jian-mei
（College of Agriculture＆Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，Gansu，China）

The study aim to obtain the optimal of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus by investigating effects of different fermentation conditions on mycelium of Polyporus umbellatus，with mycelium as an indicator.In this study，the liquid shake flask culture method was used.In different conditions（various temperatures，pH，fluid volume and incubation times），the mycelium of Polyporus umbellatus was determined to find the best fermentation condition for fermentation in each single factor.Subsequently，the mycelium fermentation conditions were optimized by using L9（34）orthogonal experiment design，and the results showed that the optimal fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus were temperature of 25℃，pH of 5.5，incubation time of 11 d and fluid volume of 100 mL/250 mL.So，content of mycelium of Polyporus umbellatus reached the maximum 1.023 g/100 mL，suggesting that optimization of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus could effectively improve content of mycelium of Polyporus umbellatus.

Polyporus umbellatus；mycelium；liquid fermentation；orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.028

2014-03-04

豆宏瑤（1995—），女（漢），在讀本科生，研究方向：食品工程。

高慧娟（1977—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵。