趙 格,康陽妃,劉津?qū)?張宇昊,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué)國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,重慶 400715)

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膠原明膠化程度快速評價(jià)體系構(gòu)建分析與展望

趙 格1,康陽妃1,劉津?qū)?,張宇昊1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué)國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,重慶 400715)

明膠得率和凝膠強(qiáng)度是傳統(tǒng)膠原明膠化程度評價(jià)的主要指標(biāo),但其值測得必須要完成膠原蛋白明膠化和熱力提膠兩個過程。熱力提膠后明膠得率和凝膠強(qiáng)度與明膠化過程中膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān),因此直接根據(jù)明膠化的膠原特征結(jié)構(gòu)來評價(jià)其明膠化,可以大幅度節(jié)約研究時(shí)間和成本。本文根據(jù)傳統(tǒng)酸堿法、酶法、超高壓法誘導(dǎo)膠原明膠化過程中的微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,結(jié)合明膠化膠原特征結(jié)構(gòu)及其評價(jià)的主要指標(biāo)的關(guān)系,對基于特征分子結(jié)構(gòu)的膠原明膠化評價(jià)方法的構(gòu)建進(jìn)行了可行性分析和展望。

明膠,膠原蛋白,明膠化,微觀結(jié)構(gòu),快速評價(jià)

明膠是一種重要的生物大分子物質(zhì),以其良好的凝膠性、乳化性和持水性等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-3]。明膠的制備工藝分為膠原的明膠化和熱力提膠兩個部分。目前,在工業(yè)生產(chǎn)中可大規(guī)模誘導(dǎo)膠原明膠化的方法只有酸堿法,但該工藝存在著生產(chǎn)周期長、效率低、污染嚴(yán)重等問題。此外,酸堿還會造成膠原共價(jià)鍵的隨機(jī)斷裂,破壞膠原亞基的完整性,從而降低明膠品質(zhì)[1,4-5]。針對酸堿法的弊端,國內(nèi)外學(xué)者[5-10]對酶法、超高壓法等改進(jìn)工藝進(jìn)行了研究,不僅可以有效的誘導(dǎo)膠原明膠化,而且環(huán)保清潔,明膠品質(zhì)好,但因其成本較高,還尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,因此明膠化方法還需改良。目前,明膠化的評價(jià)方法主要根據(jù)明膠提取后的得率和凝膠強(qiáng)度來評價(jià),每個因素的選擇優(yōu)化均要完成明膠制備的全過程,而明膠熱提取、干燥等過程通常要超過24h,如此操作不僅耗時(shí)長,而且原料浪費(fèi)大。研究表明,明膠化過程中膠原會產(chǎn)生一系列微觀結(jié)構(gòu)的變化,其變化程度與明膠得率與凝膠強(qiáng)度緊密聯(lián)系[1,2,11]。因此,如果結(jié)合明膠化膠原典型的微觀結(jié)構(gòu)與明膠得率和凝膠強(qiáng)度的關(guān)系,并以此為依據(jù)構(gòu)建明膠化膠原評價(jià)體系,即可對新型明膠化膠原誘導(dǎo)方法做出快速評價(jià),較傳統(tǒng)的方法可大幅度節(jié)約時(shí)間和成本。本文對常見的膠原明膠化誘導(dǎo)方法進(jìn)行總結(jié),并結(jié)合膠原微觀結(jié)構(gòu)的變化與明膠得率和凝膠強(qiáng)度的關(guān)系,對基于明膠化膠原特征分子結(jié)構(gòu)建立膠原明膠化程度評價(jià)方法的可行性進(jìn)行了分析,旨在為明膠產(chǎn)業(yè)的升級提供理論依據(jù)。

1 膠原明膠化誘導(dǎo)方法

1.1 酸堿法誘導(dǎo)明膠化

膠原蛋白是由原膠原分子聚合而成,每個原膠原分子由3條自身成左手螺旋結(jié)構(gòu)的α-肽鏈通過氫鍵沿公共軸平行螺旋纏繞成超螺旋,形成“三螺旋體”,膠原蛋白分子間和分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)鍵都維系著膠原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[1,11-12]。酸堿法是傳統(tǒng)的誘導(dǎo)膠原明膠化方法,該法主要利用酸或堿與膠原纖維分子上的堿性基團(tuán)或酸性基團(tuán)結(jié)合,打開其分子間和分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)和氫鍵,松散膠原的三螺旋結(jié)構(gòu),破壞非螺旋結(jié)晶區(qū),從而誘導(dǎo)膠原蛋白明膠化,這種微觀結(jié)構(gòu)變化可使膠原在熱水提膠過程中易于亞基組分(α,β,γ)的釋放,利于膠原向明膠的轉(zhuǎn)變[1-2]。朱欣星等[13]采用紅外光譜法(FT-IR)對牛跟腱中提取的I型膠原和酸法明膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,明膠不存在完整的三股螺旋結(jié)構(gòu),其原因在于膠原在明膠化和熱處理過程中,維系膠原三股肽鏈的共價(jià)交聯(lián)和氫鍵作用減弱或遭到破壞,肽鏈結(jié)構(gòu)伸展,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得無序。

明膠生產(chǎn)過程中,長時(shí)間或高濃度的酸堿處理,會導(dǎo)明膠品質(zhì)下降。閆雪等[14]采用優(yōu)化酸法提取草魚明膠研究證明了這一點(diǎn),響應(yīng)面分析結(jié)果表明,隨著鹽酸濃度的增加,明膠得率和凝膠強(qiáng)度均先增加后減少。這是由于酸導(dǎo)致膠原分子內(nèi)共價(jià)鍵(肽鍵)非正常斷裂,膠原亞基完整性遭到破壞,進(jìn)而影響熱力提膠后明膠的品質(zhì)。此外,堿液水解膠原蛋白時(shí),可能會使膠原酰胺側(cè)基逐漸水解,從而使得酰胺基含量降低,精氨酸殘基變成鳥氨酸殘基;亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)結(jié)構(gòu)被破壞;富含吡咯烷區(qū)域發(fā)生水解,使明膠中Pro結(jié)構(gòu)被破壞,含量下降,進(jìn)而降低明膠凝膠強(qiáng)度[1,15-16]。

1.2 其它改進(jìn)方法誘導(dǎo)明膠化

酶法是目前用于誘導(dǎo)膠原明膠化主要改進(jìn)方法之一,在明膠化階段,普通蛋白酶可催化膠原發(fā)生部分降解,其主要是通過攻擊膠原末端多肽區(qū)域(非螺旋區(qū)域),裂解非螺旋區(qū)分子間的化學(xué)交聯(lián)鍵使三螺旋結(jié)構(gòu)松散,同時(shí)盡量不破壞或少破壞膠原三螺旋區(qū)域的α組分從而實(shí)現(xiàn)膠原明膠化[2,17]。張峰、韓應(yīng)昌等[7-8]研究均表明1398中性蛋白酶和胞外金屬內(nèi)肽酶對膠原分子內(nèi)鍵不起作用,但可作用于膠原蛋白分子的非螺旋末端肽,解散膠原大分子聚集體并使其溶解,因此可使膠原蛋白明膠化。張兵等[18]采用色譜柱-激光光散色聯(lián)用分析法(SEC-MALLS)對酸法、堿法、酶法明膠的分子量分布進(jìn)行研究,測得酶法明膠分子量分布最窄,從4.3×104g/mol到1.0×106g/mol,多分散系數(shù)最低,僅為1.470,由此可見酶法誘導(dǎo)膠原蛋白明膠化可以更好的保持膠原蛋白亞基組分的完整性,因此,酶法明膠分子量分布更為集中。

超高壓是近年來一種較為環(huán)保、有效的膠原明膠化新技術(shù),超高壓通過影響維系穩(wěn)定膠原蛋白結(jié)構(gòu)的氫鍵等非共價(jià)鍵,從而破壞膠原非共價(jià)鍵,利于后期熱處理過程中亞基組分的釋放[2,19]。Gómez-guillén等[9,12]采用超高壓技術(shù)處理魚皮制備明膠,其研究表明一定的超高壓能促進(jìn)交聯(lián)的斷裂,明顯縮短膠原明膠化時(shí)間,而且高壓可誘導(dǎo)蛋白聚合度增加,增加明膠中高分子質(zhì)量亞基組分。張宇昊等[10,20]采用超高壓輔助提取魚皮明膠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過優(yōu)化超高壓作用可顯著增加明膠得率,同時(shí)提高了其品質(zhì):在作用壓力300MPa,超高壓時(shí)間10min,提取溫度50～60℃,提取時(shí)間4h的條件下,明膠得率最高,達(dá)到了75.03%,比傳統(tǒng)工藝高了8.9%,凝膠強(qiáng)度可達(dá)274g,其原因是魚皮和豬皮中的膠原的天然構(gòu)象是由一些非共價(jià)鍵的相互作用來維系的,高壓處理會破壞共價(jià)鍵的作用從而導(dǎo)致膠原天然結(jié)構(gòu)改變,因此超高壓可以提高明膠得率[21]。

在此基礎(chǔ)上,張宇昊[22]對超高壓輔助提取豬皮明膠工藝進(jìn)行了研究,其結(jié)果表明:采用低濃度HCl為傳壓介質(zhì)的酸/UHP可有效誘導(dǎo)膠原明膠化,在壓力250MPa、時(shí)間10min、0.75%酸的條件下,明膠得率可達(dá)88.62%,凝膠強(qiáng)度可達(dá)384.43g,其結(jié)果推測超高壓與酸結(jié)合時(shí),高壓不僅可破壞膠原的非共價(jià)鍵平衡,還可促進(jìn)酸和水分子進(jìn)入膠原原有的致密疏水空腔,加速酸對膠原分子的作用及水合作用,二者協(xié)同增效,促使膠原分子在較短時(shí)間內(nèi)游離出來并溶脹,大大縮短預(yù)處理時(shí)間;另外超高壓處理可促使膠原分子聚合,而以含膠原豐富的豬皮作為明膠提取原料,將更有利于大量的高分子聚合體的形成,而較多高分子量組分的存在則是形成高凝膠強(qiáng)度明膠的關(guān)鍵因素[23]。

2 膠原明膠化過程中特征結(jié)構(gòu)的變化與明膠得率和凝膠強(qiáng)度的關(guān)系

從上面可以看出,膠原明膠化過程會發(fā)生很多微觀結(jié)構(gòu)的變化,不同的明膠化誘導(dǎo)方法,導(dǎo)致的膠原微觀結(jié)構(gòu)的變化有一定差異,但總體上,其變化有著一定共同性,主要體現(xiàn)在膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)降解和亞基釋放[1,24]。陳麗清等[19,22]在用豬皮制備明膠的研究中發(fā)現(xiàn),預(yù)處理方法不同,明膠得率提取率差異較大,未經(jīng)任何預(yù)處理組的明膠得率提取率最低,主要因?yàn)樵谀z原保持完整三螺旋結(jié)構(gòu)的前提下對其進(jìn)行熱處理,降解比較困難,且產(chǎn)物分子量分布分散,凝膠特性差,而適宜的酸處理組得率較高,是因?yàn)樗嵴T導(dǎo)明膠化過程對三螺旋結(jié)構(gòu)有一定破壞,導(dǎo)致熱處理過程中降解較無預(yù)處理組容易,且肽鍵斷裂位點(diǎn)較為均勻,產(chǎn)物分子更加集中。潘楊等[25]采用酸堿法與熱水浸提相結(jié)合的方法制備鳙魚魚鱗明膠,得出最佳的浸酸工藝條件為酸濃度3%,時(shí)間6h,最佳浸堿工藝條件為堿濃度3%,時(shí)間12h,當(dāng)酸或堿濃度高于3%明膠提取率會降低,明膠的得率和凝膠強(qiáng)度也會顯著降低,此外,預(yù)處理時(shí)間過長也會產(chǎn)生同樣的影響,其原因可能在于酸堿處理過度會造成膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,膠原亞基完全暴露在酸堿中造成隨機(jī)降解進(jìn)而溶解,導(dǎo)致明膠得率下降,同時(shí)亞基組分的降解也導(dǎo)致明膠中高分子亞基組分含量降低,明膠的凝膠強(qiáng)度下降。由此可見通過預(yù)處理適當(dāng)破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)對于獲得高得率和高品質(zhì)明膠至關(guān)重要[11,26]。

Fernández-Díaz等[27]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析了以新鮮冷凍魚皮為原料制備的明膠的亞基組成,發(fā)現(xiàn)在-12℃時(shí)明膠含有大量α組分,但β和γ組分少,而-20℃沒出現(xiàn)這樣的情況,間接推測出冷凍誘導(dǎo)膠原分子共價(jià)交聯(lián),使得膠原亞基的溶解和提取難度更加困難?？梢娔z原中的共價(jià)交聯(lián)對于明膠提取具有顯著影響。Chen等[28]研究了超高壓誘導(dǎo)膠原蛋白明膠化過程中壓力對明膠得率的影響,證明采用300MPa壓力預(yù)處理,可獲得最高的明膠得率,更高的壓力會導(dǎo)致明膠得率的降低,并分析主要原因在于超高壓對膠原蛋白中氫鍵的影響,超高壓壓力大于300MPa時(shí),可能會導(dǎo)致膠原蛋白中新的氫鍵形成進(jìn)而形成聚集體,不利于提膠過程中明膠的釋放。由此可見膠原中氫鍵存在狀況同樣影響明膠提取。

Eysturskare等[29-30]曾探究了凝膠強(qiáng)度與平均分子量及各組分相對含量的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)凝膠強(qiáng)度和平均分子量及其分布有一定的相關(guān)性,且與α組分、β組分及高分子量組分成正相關(guān),而與低分子量組分(分子量小于α組分)成負(fù)相關(guān)。陳麗娟等[31-32]研究也表明明膠的α組份含量與膠凍強(qiáng)度(也叫凝膠強(qiáng)度)之間存在線性關(guān)系,α1和α2組份含量越高,凝膠強(qiáng)度越高。明膠中亞基組分的含量對明膠的凝膠特性具有很大影響。Chen等[28]研究證明,采用超高壓誘導(dǎo)的明膠化膠原,亞基組分含量高于傳統(tǒng)酸處理的明膠化膠原,且超高壓明膠較傳統(tǒng)的酸處理明膠具有更優(yōu)的凝膠特性,表明明膠中亞基組分同明膠化膠原中的亞基組分含量直接相關(guān)。因此,在膠原明膠化過程中,應(yīng)盡量只破壞維持膠原穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵平衡,以保持亞基組分的完整性,才能制出高凝膠強(qiáng)度的明膠。

由此可見,研究膠原明膠化過程,三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性和亞基組分的含量可作為評價(jià)膠原明膠化程度的特征結(jié)構(gòu)。

3 膠原明膠化程度評價(jià)方法建立可行性分析

由以上分析可見,膠原的明膠化主要涉及到其特征結(jié)構(gòu)的變化,其變化程度將直接或間接影響到后期提取的明膠的相關(guān)指標(biāo)。因此,對明膠化膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)完整性以及亞基組分含量等特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化,并結(jié)合明膠提取后的得率和凝膠強(qiáng)度等指標(biāo),采用回歸分析建立模型,即可利用其特征分子結(jié)構(gòu)量化值直接對膠原明膠化程度進(jìn)行快速評價(jià)。模型構(gòu)建的關(guān)鍵主要在于特征結(jié)構(gòu)的量化和回歸模型的選擇。

研究表明,三螺旋結(jié)構(gòu)和亞基組分均可被快速測定并予以量化。三螺旋結(jié)構(gòu)可以采用紅外光譜或拉曼光譜測定并量化。Li等[33]對熱變性、胃蛋白酶處理和超聲波胃蛋白酶處理的膠原蛋白的紅外光譜分析表明,3330cm-1和 2930cm-1附近分別是酰胺A帶和酰胺B帶的N-H伸縮振,1636～1661cm-1是酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮和N-H彎曲振動,1549～1558cm-1是酰胺Ⅱ帶C-N 伸縮和N-H彎曲振動,其研究還發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶處理和超聲波胃蛋白酶處理的膠原蛋白的酰胺帶的分布和強(qiáng)度一致,而熱變性膠原的酰胺帶強(qiáng)度降低,說明了熱變性膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。劉蘇銳等[34]提取的豬皮Ⅰ型膠原蛋白紅外圖譜中的1160cm-1附近酰胺Ⅰ帶C=O基團(tuán)的伸縮振動,1550cm-1附近酰胺Ⅱ帶N-H彎曲振動以及3340cm-1附近的N-H伸縮振動都表明了肽鏈氫鍵的存在,同時(shí)說明了豬皮Ⅰ型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。Norizah等[35]采用拉曼光譜測定了牛皮明膠和雞皮明膠的二級結(jié)構(gòu),并且對明膠各種特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化,進(jìn)而分析了二者的差異。由此可見,由此可見,對三螺旋結(jié)構(gòu)的測定和量化可行。對于亞基組分的研究,通常采用SDS-PAGE進(jìn)行,Chen等[28]采用SDS-PAGE對不同壓力下超高壓明膠亞基組分進(jìn)行測定,并采用Phoretix 1D 軟件對亞基組分進(jìn)行定量和比較,確定了300MPa的處理可以使明膠中亞基組分含量更高。由此可見對于亞基組分量化可行。

回歸模型選擇方面尚未見報(bào)道,從明膠得率以及凝膠強(qiáng)度隨酸處理時(shí)間變化趨勢分析,隨著酸處理時(shí)間的延長,明膠得率和凝膠強(qiáng)度主要呈現(xiàn)先上升,后下降或者區(qū)域平穩(wěn)的趨勢[10,36-38]。本課題組初步研究表明[39],隨著酸處理時(shí)間延長膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)含量呈現(xiàn)下降趨勢,但后期下降趨勢有所放緩;此外,膠原的亞基組分隨著酸處理時(shí)間的延長同樣呈現(xiàn)下降趨勢。由此推斷,在特征結(jié)構(gòu)與明膠得率和凝膠強(qiáng)度模型構(gòu)建時(shí),Linear、Llogarithmic、Quadratic、Cubic等模型有可能會有較高的相關(guān)性。

綜上所述,明膠化膠原中三螺旋結(jié)構(gòu)、氫鍵和亞基組分均可被快速測定并予以量化,將其同明膠得率和凝膠強(qiáng)度構(gòu)建回歸模型,有望快速預(yù)測不同明膠化程度膠原用于提膠后,所得明膠的得率和凝膠強(qiáng)度。因此,建立膠原明膠化程度快速評價(jià)方法具有可行性。

4 展望

明膠作為一種非常重要的天然生物高分子材料,被廣泛應(yīng)用于食品、照相、醫(yī)藥等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的明膠生產(chǎn)工藝存在耗時(shí)長、效率低、污染環(huán)境等缺點(diǎn),嚴(yán)重阻礙了明膠的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,因此明膠化改進(jìn)工藝成為了研究熱點(diǎn),但其評價(jià)方法主要依據(jù)最終產(chǎn)品的得率與特性,這個操作需要完成整個明膠制備過程,耗時(shí)費(fèi)力,成本較高。因此建立新型明膠化快速評價(jià)方法對明膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要意義。

明膠化膠原的特征結(jié)構(gòu)會影響明膠提取后的相關(guān)指標(biāo),其中三螺旋結(jié)構(gòu)、氫鍵和亞基組分均可被快速測定并予以量化,如果將明膠化膠原的特征結(jié)構(gòu)結(jié)合明膠的得率、凝膠強(qiáng)度等指標(biāo)構(gòu)建預(yù)測模型,有望用于不同明膠化程度膠原在提膠后所得明膠指標(biāo)的預(yù)測。

總的來說,直接根據(jù)明膠化膠原的特征分子結(jié)構(gòu)來評價(jià)明膠化程度比熱力提膠后再根據(jù)明膠相關(guān)指標(biāo)更節(jié)約時(shí)間和成本,并有望通過研究明膠化膠原的特征結(jié)構(gòu)來控制預(yù)處理?xiàng)l件以提高明膠的得率和品質(zhì)。結(jié)合明膠化膠原特征分子結(jié)構(gòu)和后期相關(guān)指標(biāo)建立基于特征分子結(jié)構(gòu)的膠原明膠化程度評價(jià)方法具有重要意義,可為明膠的工藝改進(jìn)乃至明膠產(chǎn)業(yè)的升級提供幫助。

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Analysis and prospect on rapidly evaluated systemfor gelatinization of collagen

ZHAO Ge1,KANG Yang-fei1,LIU Jin-ning1,ZHANG Yu-hao1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Gelatin yield and gel strength are the main evaluation indicators of the gelatinization degree of collagen,but the value measured must complete gelatinization of collagen and hot water extraction two process. Therefore,it can greatly save research time and costs that directly evaluate the gelatinization degree of collagen with the typical structure of the collagen. According to variation of microstructure of collagen treated by traditional acid-alkali,enzyme and ultra-high pressure,relationship between typical structures of gelatinized collagen and main evaluation indicators were discussed. Meanwhile,the evaluated methods based on the typical microstructure for gelatinization of collagen were analyzed and predicted.

gelatin;collagen;gelatinization;microstructure;rapid evaluation

2014-06-12

趙格(1992-)，女，本科在讀，研究方向:食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者:張宇昊(1978-)，男，博士，副教授，研究方向:蛋白質(zhì)與生物活性肽。

“國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目(201310635011)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301425)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(XDJK2011B001)；中國博士后基金面上項(xiàng)目(2014M562267)。

TS209

A

1002-0306(2015)05-0370-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.070