郭 婕,劉中華,袁淑培,王永立,李俐俐

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南周口 466000)

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黑豆中大豆異黃酮微波提取工藝的優(yōu)化

郭 婕,劉中華,袁淑培,王永立,李俐俐

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,河南周口 466000)

采用微波提取法,利用單因素和L9(34)正交實(shí)驗(yàn),對黑豆中大豆異黃酮提取率的影響因素及最佳提取工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明,料液比、乙醇濃度、微波功率、微波處理時間對黑豆中大豆異黃酮的提取率均有不同程度的影響,其中微波功率對異黃酮的提取率影響顯著(p<0.05)。最佳提取工藝為料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率為300W、微波處理2min。在最佳提取條件下,黑豆中大豆異黃酮的得率為0.488%±0.01%。該提取工藝穩(wěn)定可行,可為大豆異黃酮的提取提供參考。

黑豆,大豆異黃酮,微波提取

黑豆系豆科植物中種皮為黑色的大豆,具有悠久的食用和藥用歷史[1]。《本草綱目拾遺》中記載,長期食用黑豆可以強(qiáng)身健體、滋養(yǎng)肌膚、美容烏發(fā),具有延緩衰老的功效[2]。黑豆除了營養(yǎng)豐富外,同時又具有多種生物活性物質(zhì),如黑豆色素、多糖和異黃酮等[3]。大豆異黃酮是大豆等豆科植物生長過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[4],是大豆中主要的活性物質(zhì)。異黃酮與人體健康密切相關(guān),具有許多生理功能,如抗氧化、抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、改善更年期綜合癥等[5-6]。我國先人藥用多選黑豆,這可能與異黃酮類含量有關(guān)[7]。

微波輻射容易破壞細(xì)胞,從而使異黃酮在短時間內(nèi)從細(xì)胞內(nèi)溶出[8]。微波輔助提取法與常規(guī)溶劑浸提法相比,具有省時、節(jié)約溶劑、產(chǎn)品純度及提取率高[9]等優(yōu)勢,且提取的有效成分沒有明顯區(qū)別。目前,微波輔助法已應(yīng)用于中藥、豆科植物及豆類產(chǎn)品副產(chǎn)物中異黃酮的提取,如葛渣[10]、槐角[11]、豆渣[12]等,但利用微波輔助法對黑豆中大豆異黃酮提取工藝的研究鮮有報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助法提取黑豆中的大豆異黃酮,以異黃酮含量為指標(biāo),在料液比、乙醇濃度、微波功率、微波處理時間四個單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交實(shí)驗(yàn)確定黑豆中異黃酮的最佳提取條件。我國黑豆資源豐富,以黑豆為原料,開發(fā)利用大豆異黃酮及相關(guān)產(chǎn)品具有便利的條件。以期為黑豆中大豆異黃酮的工業(yè)化提取提供參考,也為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及在保健食品中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆 產(chǎn)自河南省周口市巴集鄉(xiāng)。染料木素 上海金穗生物科技有限公司 HPLC≥98%;無水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠 分析純;正己烷 天津市富宇精細(xì)化工有限公司 分析純;次氯酸鈉 武漢華威化工儀器有限公司 分析純。

UV-5100型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)室微波爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆中大豆異黃酮提取工藝流程 黑豆干燥至恒重,粉碎,過40目篩,稱重→按照料液比1∶3加入正己烷,脫脂2次[13]→低溫干燥,粉碎,過40目篩→準(zhǔn)確稱取2g→加入乙醇,室溫浸泡0.5h,微波提取2次→抽濾→合并提取液→加乙醇溶液定容至100mL→260nm處測吸光度。

1.2.2 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL濃度為40μg/mL的染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于各試管中,加70%乙醇定容至10mL,搖勻,以70%乙醇調(diào)零,在260nm處測定吸光度[14]。以待測試管中染料木素的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并作回歸處理,得回歸方程y=0.1166x-0.0015,R2=0.9998。

1.2.3 黑豆中大豆異黃酮提取率的測定 從稀釋的樣品提取液中各取1mL,置于10mL的試管中,依照上述方法處理,于波長260nm處測定吸光度。按照以下公式計(jì)算黑豆豆芽異黃酮的得率(%)。

大豆異黃酮的得率(%)=cVK×10-4/W

式中:c為測量液中異黃酮的濃度(μg/mL);V為提取液的體積(mL);K為提取液稀釋的倍數(shù);W為原料的干重(g)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 對預(yù)處理過的黑豆粉,利用微波提取法,以異黃酮含量為指標(biāo),經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)初步考察料液比、乙醇濃度、微波功率、微波處理時間四個因素對黑豆中大豆異黃酮得率的影響。

以70%乙醇為提取劑,分別設(shè)置料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL),微波功率為450W,微波處理2min,研究料液比對黑豆中大豆異黃酮得率的影響。

分別以濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇做提取劑,料液比1∶20(g/mL),微波功率為450W,微波處理2min,研究乙醇濃度對黑豆中大豆異黃酮得率的影響。

以60%乙醇為提取劑,料液比1∶20(g/mL),微波處理2min,研究不同微波功率150、300、450、600、750W對黑豆中大豆異黃酮得率的影響。

以60%乙醇為提取劑,料液比1∶20(g/mL),微波功率為300W,分別微波處理0.5、1、2、3、4、5min,研究不同微波時間對黑豆中大豆異黃酮得率的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交表對以上四個因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化,確定黑豆中大豆異黃酮的最佳提取條件。因素水平安排見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003和正交設(shè)計(jì)助手進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比的初步篩選 由圖1可知,當(dāng)料液比為1∶20時,黑豆中大豆異黃酮得率最高,為0.217%±0.009%;隨著料液比的增加或減少,異黃酮得率均有降低趨勢。在一定范圍內(nèi),提取溶劑較多時,提取液中大豆異黃酮的濃度低,增大了大豆異黃酮在固液相中的濃度差[15],有利于大豆異黃酮擴(kuò)散至提取劑中。而料液比繼續(xù)增加,溶劑對微波能量的吸收增加,細(xì)胞對微波能量的吸收減少,細(xì)胞壁破裂程度相對減少,大豆異黃酮從細(xì)胞中溶出量減少[16]。且提取劑過多,導(dǎo)致其他雜質(zhì)過多溶出,影響異黃酮溶解[17]。初步確定料液比為1∶20(g/mL)。

圖1 料液比對黑豆中大豆異黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.2 乙醇濃度的初步篩選 由結(jié)果圖2可知,乙醇濃度較小時,隨著乙醇濃度的提高,黑豆中大豆異黃酮得率增大,在60%達(dá)到最高為0.279%±0.008%;隨著乙醇濃度繼續(xù)提高,異黃酮得率開始降低。其原因是乙醇濃度過低,導(dǎo)致醇提不能充分進(jìn)行,使得得率降低。乙醇濃度過高或者過低都與異黃酮的極性不一致[18],對異黃酮的提取均有抑制作用。初步選擇乙醇濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對黑豆中大豆異黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.3 微波功率的初步篩選 由結(jié)果圖3可知,微波功率為300W時,黑豆豆芽中大豆異黃酮得率最高,為0.322%±0.009%。功率低于或高于300W時,異黃酮得率均稍低。主要原因是在一定范圍內(nèi),隨著微波功率的增大,細(xì)胞壁破裂程度加大,異黃酮浸出量隨之升高[19]。但微波功率過高時,溶劑分子的劇烈運(yùn)動占主導(dǎo)地位,溶液中的蛋白質(zhì)變性,進(jìn)而對黑豆中的異黃酮分子產(chǎn)生不可逆束縛作用,阻礙異黃酮分子的浸出[20]。故初步選擇微波功率為300W。

圖3 微波功率對黑豆中大豆異黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction yield of soybean isoflavones

2.1.4 微波處理時間的初步篩選 由結(jié)果圖4可知,隨著微波處理時間從0.5min增至5min,黑豆中大豆異黃酮得率逐漸增大后有所下降,在3min時,得率達(dá)到最高為0.389%±0.007%。其原因是微波處理時,在一定范圍內(nèi),提取時間的延長有助于黑豆粉顆粒的溶脹及異黃酮的溶出,使提取率提高[21]。但微波時間過長,溫度升高,異黃酮不穩(wěn)定易分解,使提取率降低[22]。初步選擇微波處理時間為3min。

圖4 微波處理時間對黑豆中大豆異黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave-heating time on the extraction yield of soybean isoflavones

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

為確定黑豆中大豆異黃酮的最佳提取條件,根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)所確定的單因素條件,選取四因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化,所得正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 提取率方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction yield

通過正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2極差分析可知,影響黑豆中大豆異黃酮提取率的幾個因素順序?yàn)?微波功率>料液比>微波處理時間>乙醇濃度。方差分析表3顯示微波功率對黑豆豆芽中大豆異黃酮的得率影響表現(xiàn)顯著(p<0.05)。綜合極差和方差分析得出最佳組合為A3B2C2D1,即黑豆中大豆異黃酮的最佳提取條件:料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率為300W、微波處理2min。按照最佳提取條件重復(fù)三次,進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),所得黑豆中大豆異黃酮的得率分別為0.495%、0.476%、0.492%。故最佳提取條件下,黑豆中大豆異黃酮得率為0.488%±0.01%。

3 結(jié)論

以大豆異黃酮為指標(biāo),利用紫外分光光度法測定黑豆豆芽中大豆異黃酮的含量。通過單因素及L9(34)正交實(shí)驗(yàn),分析料液比、乙醇濃度、微波功率和微波處理時間對黑豆豆芽中大豆異黃酮得率的影響,并優(yōu)化最佳提取條件。經(jīng)分析可知,影響異黃酮提取率的幾個因素主次順序?yàn)?微波功率>料液比>微波處理時間>乙醇濃度,其中微波功率對異黃酮的提取率影響表現(xiàn)顯著(p<0.05)。黑豆中大豆異黃酮的最佳提取條件:料液比1∶25(g/mL)、60%乙醇、微波功率為300W、微波處理2min。經(jīng)驗(yàn)證,此條件下黑豆中大豆異黃酮提取率為0.488%±0.01%。

微波輔助法提取黑豆中大豆異黃酮操作簡便、可行,且產(chǎn)品提取率高,可以為進(jìn)一步研究黑豆中大豆異黃酮的分離、純化,及其在食品、醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供參考。

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Optimization of microwave-assisted extraction technologyof soybean isoflavones from black soybean

GUO Jie,LIU Zhong-hua,YUAN Shu-pei,WANG Yong-li,LI Li-li

(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466000,China)

Microwave-assisted extraction was used to extract soybean isoflavones from black soybean. The influence factors of impacting extraction yield and the optimal extraction conditions were studied by single factor and L9(34)orthogonal experiment. The results showed that all the factors including solid-liquid ratio,ethanol concentration,microwave power and microwave-heating time had different effects on the yield of soybean isoflavones. And the effect of microwave power was significant(p<0.05). The optimal conditions were as follows:the 1∶25(g/mL)ratio of solid-liquid,60% ethanol,microwave power was 300W,extracting for 2min. The yield of soybean isoflavones was up to 0.488%±0.01% under these conditions. The method was stable and feasible,which could be applied for the extraction of soybean isoflavones.

black soybean;soybean isoflavones;microwave-assisted extraction

2014-07-09

郭婕(1984-),女,碩士,講師,研究方向:天然藥物化學(xué)。

周口師范學(xué)院大學(xué)生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(ZKNUDXS2014-021);河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2010B180032)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)05-0255-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.045