王南溪,楊 偉,楊春平,楊 樺,楊學圳,沈雨曦

(四川農(nóng)業(yè)大學林學院,森林保護省級重點實驗室,四川雅安 625014)

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大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶能力和抗疲勞能力的影響

王南溪,楊 偉*,楊春平,楊 樺,楊學圳,沈雨曦

(四川農(nóng)業(yè)大學林學院,森林保護省級重點實驗室,四川雅安 625014)

為探討大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對KM小鼠學習記憶能力和抗疲勞能力的影響,本文采用Morris水迷宮法、爬竿實驗和負重游泳實驗分別測試灌胃了不同劑量該酶解產(chǎn)物30d后小鼠學習記憶與抗疲勞的情況。結(jié)果顯示,Morris水迷宮實驗中,未灌胃大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的對照組潛伏期比低、中、高劑量組長17.2%～62.8%,反應次數(shù)少19.7%～164.3%,且中劑量組的潛伏期和反應次數(shù)與對照組差異均極顯著(p<0.01)。爬竿實驗和負重游泳實驗中,未灌胃該酶解產(chǎn)物的對照組負重游泳成績比其他三組低1.9%～16.4%;爬竿成績低6.2%～29.8%,其中,中劑量組的這兩項實驗成績均極顯著高于低、高劑量組(p<0.01)。表明大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物具有提高小鼠學習記憶能力和抗疲勞能力的功效,且影響程度與其劑量有關,中劑量(1.67g/(kg·d))為較適劑量。

大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物,KM小鼠,學習記憶能力,抗疲勞能力

蛋白質(zhì)的攝入量反映了一個國家的營養(yǎng)水平[1],已有研究表明,我國人均蛋白質(zhì)攝入量低于世界平均水平[2],其攝入量的不足會給人體健康帶來隱患。如何解決蛋白質(zhì)資源短缺的問題,并提高我國居民膳食水平,已經(jīng)到了迫在眉睫的程度。因此,越來越多的人將目光投向新型蛋白源昆蟲—大麥蟲(ZophobsmorioL.),其不僅繁殖速度快,具有一定的人工養(yǎng)殖規(guī)模[3],且較其他資源昆蟲而言蛋白質(zhì)含量豐富,鮮蟲體的粗蛋白含量為22.3%[4-6];氨基酸組成合理,必需與非必需氨基酸的比值達0.79～0.88[7],超過了FA/WHO標準的推薦值[8]。大麥蟲蛋白質(zhì)具有健腦益智、調(diào)節(jié)免疫力、增強抗疲勞力等功效,其經(jīng)酶解后生成的氨基酸和多肽更易被動物體吸收[9]。但是,目前對大麥蟲的研究還停留在飼料及飼料添加劑的開發(fā)利用層面上[10-11],對其在食品及食品添加劑、昆蟲蛋白生物活性功能方面的研究尚少[12-14]。本文以大麥蟲幼蟲為蛋白質(zhì)原料,用堿性蛋白酶酶解脫脂蟲粉獲得的酶解產(chǎn)物灌胃處理KM小鼠,并采用Morris水迷宮法、爬竿實驗和負重游泳實驗分別測試灌胃不同劑量酶解產(chǎn)物的小鼠的學習記憶與抗疲勞效果,并分析該酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶能力與抗疲勞能力的影響,為進一步開發(fā)和利用大麥蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

KM小鼠 雌雄各40只體重在(20±2)g的斷乳小鼠；4kg大麥蟲幼蟲 均由四川農(nóng)業(yè)大學森林保護實驗室提供;乙醚 西隴化工股份有限公司,分析純;堿性蛋白酶 濰坊奧迪爾進出口貿(mào)易有限公司;氫氧化鈉 中國成都高欣化學試劑廠,分析純;鹽酸 西隴化工股份有限公司,分析純。

DHG-9104電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;LD-Y300A型粉碎機 上海頂帥電器有限公司;SZF-06A型脂肪儀 上海精隆科學儀器有限公司;飛鴿牌TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠;JA2003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司;Morris水迷宮 上海欣軟信息科技有限公司;EthoVision3.0行為分析儀 荷蘭諾達斯信息技術有限責任公司;DELTA320型pH計 上海摩速科學器材有限公司;DK-S26恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;S212恒速電動攪拌器 上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司;WI64537爬桿實驗裝置 上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 樣品的制備與特性

將4kg大麥蟲幼蟲洗凈放入80℃的烘箱中干燥至恒重,用粉碎機將其打磨成粉,并用定性濾紙包裹。將包好的蟲粉放入裝有150mL無水乙醚的索氏提取器,并置于55℃的恒溫水浴鍋中?？刂埔颐鸦亓鞔螖?shù)為(10±2)次/h,試樣抽提8h后取出。將得到的脫脂蟲粉烘干后加水配成濃度為6.7%±0.2%的溶液并煮沸滅菌10min,然后置于恒溫攪拌器中加熱至(59.5±0.5)℃。稱取適量堿性蛋白酶于(59.5±0.5)℃的恒溫水浴鍋中加熱10min,用NaOH溶液調(diào)pH至9.3±0.1后迅速加入備好的脫脂溶液酶解(3.2±0.4)h,酶底質(zhì)量比為3.7%±0.2%,酶解過程中不斷加入HCl溶液和NaOH溶液以維持pH恒定。酶解結(jié)束,沸水浴10min滅酶,冷卻至室溫,經(jīng)10000r/min離心10min,取上清液冷藏備用,得到的大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的多肽含量為38.847mg/mL[15-18]。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及給藥 實驗小鼠的分組及飼養(yǎng):KM小鼠雌雄各20只隨機分成4組,即智力組大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的低、中、高劑量組(A1、A2、A3),對照組(A4),每組雌雄小鼠各5只;另選雌雄各20只小鼠按照相同的方法處理,即體力組,用B表示。整個實驗期間,各組小鼠自由取食和飲用相同的飼料和酸化水,室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃。

大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物劑量設定與灌胃:根據(jù)戚穎欣等人[19]報道的蠶蛹蛋白肽的人體推薦用量來計算出樣品的適用量為0.167g/(kg·d)。將低、中、高劑量設計為適用量的5倍、10倍、25倍,分別為0.83、1.67、4.17g/(kg·d),對照組為陰性對照。連續(xù)30d,每天定時給各組小鼠灌胃相應劑量的樣品,每2d稱重一次并調(diào)整灌胃劑量。最后一次灌胃的次日開始對A、B組小鼠分別進行水迷宮實驗和爬桿、負重游泳實驗。

1.3.2 小鼠Morris水迷宮實驗 將灌胃結(jié)束后的A組小鼠放入水迷宮(Φ=90 cm)中進行記憶訓練,實驗水溫(25±2)℃。每只小鼠每天訓練其搜尋平臺4次,每次2min,如果2min未搜尋到平臺,教其爬上平臺。對小鼠進行4d的水迷宮訓練后第5d撤掉平臺測試其學習能力,每只小鼠測試1次。休息4d后,在第10d依照第5d的方法再次測試小鼠的記憶能力[20]。學習與搜尋行為均由EthoVision3.0行為分析儀進行記錄與分析。

1.3.3 小鼠爬桿、負重游泳實驗 小鼠爬桿實驗:末次灌胃后24h將B組小鼠放在置于水溫(15±0.5)℃、深10cm的水盆上方的有機玻璃桿上端并讓其自主抓住爬桿,使其肌肉處于靜力緊張狀態(tài)。記錄小鼠從抓住爬桿到因肌肉疲勞無力從爬桿上滑落的時間,每只小鼠測試3次,累計3次時間為小鼠的爬桿成績。

小鼠負重游泳實驗:爬竿實驗結(jié)束后,再次灌胃B組小鼠,24h后稱量小鼠體重并做好記錄。給每只小鼠的尾根部負荷其自身體重5%的鉛皮,然后將小鼠放入水溫為(25±1)℃的游泳箱,開始測試。記錄小鼠自開始游泳至溺水死亡的時間,作為其負重游泳成績。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EthoVision3.0行為分析軟件處理Morris水迷宮實驗的數(shù)據(jù),經(jīng)行為儀處理后所得的水迷宮實驗結(jié)果和爬桿實驗結(jié)果、負重游泳實驗結(jié)果均采用SPSS15.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠體重增長的影響

本實驗測定小鼠在灌胃大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物前及30d后的體重變化,并分別對智力組和體力組中不同劑量處理的小鼠的體重進行多重比較,見表1。經(jīng)分析,灌胃前智力組和體力組中各處理的體重差異均不顯著(p>0.05)。灌胃該酶解產(chǎn)物30d后,智力組與體力組中對照組小鼠的體重均極顯著低于低、中、高劑量組(p<0.01);而高劑量組與低劑量組差異極顯著(p<0.01),與中劑量組無顯著差異(p>0.05),且兩組內(nèi)各處理的小鼠平均增重量呈現(xiàn)出從高、中、低劑量組到對照組依次降低的規(guī)律。

表1 大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠體重的影響(n=10)Table 1 Effects of Zophobs morio protein hydrolysates on weight of mice(n=10)

注:W0:灌胃前KM小鼠的體重;WT:灌胃30d后KM小鼠的體重。將表中數(shù)據(jù)進行同列比較,大寫字母不同表示差異極顯著(p<0.01);小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。下同。

表2 小鼠Morris水迷宮實驗訓練成績(n=10)Table 2 Training results of mice in Morris water maze test(n=10)

表3 小鼠Morris水迷宮實驗記憶及遺忘測試成績(n=10,Mean±S.E)Table 3 Test results of memory and forgetting of mice in Morris water maze test(n=10,Mean±S.E)

根據(jù)肽營養(yǎng)理論,蛋白質(zhì)以小肽的形式被吸收可以消除游離氨基酸在吸收過程中的電荷競爭,促進氨基酸和一些礦質(zhì)元素的吸收[21]。在本實驗中,大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的小肽促進了小鼠對氨基酸和礦質(zhì)元素的吸收,有利于其的生長發(fā)育,因此,灌胃了該酶解產(chǎn)物的小鼠增重量顯著大于未灌胃的。實驗表明,大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠良好的生長發(fā)育有一定的促進作用,且在給定劑量下,其增重量與灌胃該酶解產(chǎn)物的劑量呈正相關。

2.2 大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗是利用小鼠尋找隱藏在水中的休息場所來節(jié)約體力的本能,通過強迫小鼠學習尋找水中平臺來測試其對空間位置感和方向感的學習記憶能力。因此,訓練過程中小鼠找到平臺的耗時越短,成績越好;而測試過程中以潛伏期和反應次數(shù)作為小鼠空間定位學習和記憶能力的指標,潛伏期越短、反應次數(shù)越多,表明學習記憶能力越強。水迷宮實驗的訓練和測試結(jié)果的方差分析見表2和表3。

從表2中水迷宮實驗的訓練結(jié)果可得,第1d各組間的訓練成績無顯著差異(p>0.05);比較1d和4d的數(shù)據(jù)可知,低、中、高劑量組比對照組小鼠的訓練成績提高幅度大38%～130.1%。提示經(jīng)過4d的訓練,基本在同一水平上的各組小鼠的訓練成績均有所提高,且灌胃了大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的成績提高幅度均大于未灌胃的,表明該酶解產(chǎn)物可提高小鼠的訓練成績。中劑量組第2d訓練成績與對照組差異顯著(p<0.05),與低、高劑量組無顯著差異(p>0.05);第3d的訓練成績與低劑量組無顯著差異(p>0.05),與高劑量組差異顯著(p<0.05),與對照組差異極顯著(p<0.01);第4d的訓練成績與高劑量組差異顯著(p<0.05),與低劑量組和對照組的成績差異極顯著(p<0.01)。而且比較1d和4d的數(shù)據(jù)可知,中劑量組小鼠的訓練成績提高幅度比低、高劑量組大21.5%～40.1%,提示中劑量為較適劑量,對小鼠學習能力的促進效果較好。

訓練4d后,在第5d和第10d分別對小鼠進行了空間定位的學習記憶和遺忘程度的測試。通過表3可知,第5d對照組潛伏期比其他三組長19.1%～62.8%,極顯著長于中、高劑量組(p<0.01),顯著長于低劑量組(p<0.05);反應次數(shù)比其他三組少19.7%～76.1%,與中劑量組差異極顯著(p<0.01)。第10d對照組潛伏期比其他三組長17.2%～39.8%,與中劑量組差異極顯著(p<0.01);反應次數(shù)比其他三組少86.7%～164.3%(p<0.01)。提示大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物可提高小鼠的測試成績,促進其學習記憶能力。第5d中劑量組的潛伏期極顯著短于低、高劑量組(p<0.01);反應次數(shù)極顯著多于低劑量組(p<0.01),顯著多于高劑量組(p<0.05)。第10d中劑量組的潛伏期顯著短于高劑量組(p<0.05);反應次數(shù)顯著多于低、高劑量組(p<0.05)。通過分別比較各組小鼠5d和10d的測試成績可知,中劑量組兩次測試的潛伏期都是最短的,反應次數(shù)都是最多的。提示中劑量的大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶能力的保持促進效果最好。

研究表明,營養(yǎng)與學習記憶關系密切,學習記憶的過程需要食物中與各種營養(yǎng)素緊密相關的神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的參與[22]。本實驗中,灌胃大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物后小鼠的Morris水迷宮訓練和測試成績均顯著高于對照的原因可能是,該酶解產(chǎn)物給小鼠的智力發(fā)育提供的生物活性肽是其促進小鼠學習記憶能力的主要成分。而關于大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物如何影響小鼠學習記憶能力的生理生化機制,如其如何影響海馬腦源性神經(jīng)生長因子的表達量及NMDA受體基因和CREB受體基因的表達量等[23],還有待進一步研究。

2.3 大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物對小鼠抗疲勞能力的影響

本實驗以小鼠爬竿時間和負重游泳時間作為測量指標,來測定灌胃大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物30d后小鼠的體力。其中,負重游泳時間體現(xiàn)小鼠對抗運動疲勞的能力,爬竿時間體現(xiàn)其對抗靜力疲勞的能力。小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗測試成績的方差分析見表4。

表4 小鼠爬桿實驗和負重游泳實驗測試成績Table 4 Test results of pole test and weight loading swimming test

表4中,灌胃不同劑量大麥蟲蛋白酶解產(chǎn)物后對照組負重游泳成績比低、中、高劑量組低1.9%～16.4%,與低、中劑量組差異極顯著(p<0.01)。中劑量組負重游泳成績比其他三組高12.2%～14.1%(p<0.01);低劑量組成績極顯著高于對照組(p<0.01),顯著高于高劑量組(p<0.05),高劑量組與對照組無顯著差異(p>0.05)。提示灌胃小鼠該酶解產(chǎn)物的劑量與其對抗運動疲勞的能力有一定的關系,其中,中劑量更有利于提高小鼠抗運動疲勞的能力,低劑量對小鼠的該項能力也有一定的促進作用,高劑量的這項功效不明顯。

灌胃不同劑量大麥蟲蛋白酶解產(chǎn)物后對照組小鼠的爬竿成績比低、中、高劑量組低6.2%～29.8%,與低、中劑量組差異極顯著(p<0.01)。中劑量組爬竿成績比其他三組高22.5%～23.0%(p<0.01);低劑量組成績極顯著高于高劑量組和對照組(p<0.01),高劑量組顯著高于對照組(p<0.05)。提示灌胃小鼠該酶解產(chǎn)物的劑量與其對抗靜力疲勞的能力有一定的關系,其中,中劑量提高小鼠抗靜力疲勞能力的效果最好,低劑量效果其次,高劑量的這項功效不如低、中劑量。

已有研究表明,動物肌肉組織的能量主要來源于外源支鏈氨基酸,而大麥蟲幼蟲的氨基酸組成中有較多的支鏈氨基酸(占氨基酸總量的14.8%)[7]。在特殊的應急情況下,給小鼠灌胃的大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物為其補充了大量的外源支鏈氨基酸,這些支鏈氨基酸可以直接向小鼠的肌肉組織提供能量,減輕疲勞,同時使其機體更快地適應高強度的運動[24]。但從實驗結(jié)果可知,高劑量的該酶解產(chǎn)物使小鼠的增重量增多反而導致了其抗疲勞能力的降低,因此,適量的該酶解產(chǎn)物才能更好地提高小鼠的抗疲勞能力。本實驗的中劑量為大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物促進小鼠抗疲勞能力的較適劑量。

3 結(jié)論

昆蟲資源豐富、蟲體營養(yǎng)價值高,將其體內(nèi)的營養(yǎng)成分采用水解酶技術處理后可以使其產(chǎn)品的品質(zhì)、食品的營養(yǎng)和消化利用性能得到改善[25-27],可以有效的解決世界人口急劇增長帶來的資源問題。本實驗結(jié)果表明,灌胃大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物后小鼠的Morris水迷宮、爬竿和負重游泳測試成績均顯著高于對照,說明該酶解產(chǎn)物對其學習記憶能力和抗疲勞能力有一定的促進作用;而中劑量組的測試成績均顯著高于低、高劑量組,表明不同劑量該酶解產(chǎn)物對小鼠學習記憶和抗疲勞能力的提高程度不同,1.67g/(kg·d)的中劑量是提高小鼠這兩項能力的較適劑量。上述研究結(jié)果初步證明了大麥蟲蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物具有促進KM小鼠學習記憶能力和抗疲勞能力的功效,為進一步探討該酶解產(chǎn)物對動物智力及體力發(fā)育的影響,開發(fā)利用以大麥蟲幼蟲為原材料的功能性食品提供借鑒參考。

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Effect of protein hydrolysates fromZophobsmorioon learningand memory and anti fatigue abilities of mice

WANG Nan-xi,YANG Wei*,YANG Chun-ping,YANG Hua,YANG Xue-zhen,SHEN Yu-xi

(College of Forestry of Sichuan Agricultural University,Provincial Key Laboratory of Forest Protection,Ya’an 625014,China)

To investigate the effect of different doses ofZophobsmorioprotein hydrolysates on learning,memory and anti fatigue abilities,KM mice were intragastric administrated 30 days’ protein hydrolysates,through using Morris water-maze,climbing pole experiment and weight loading swimming test. Results showed that the incubation period of the control group without being administrated whose reaction times was 19.7%～164.3% less than the low,middle and high dose groups was 17.2%～62.8% longer than the other groups in the Morris water-maze,while the incubation period and reaction times of the middle dose group differed significantly from the control group(p<0.01). At the same time,the control group’s score of weight loading swimming test was 1.9%～16.4% lower than the other three groups and climbing pole experiment test was 6.2%～29.8% lower in the climbing pole experiment and weight loading swimming test,and the middle dose group got the significant higher results extremely than the low and high dose group(p<0.01). It suggested thatZophobsmorioprotein hydrolysates could enhance mice’s learning,memory and anti fatigue abilities which was significantly associated with the dosage intragastric administrated,of which moderate dosage(1.67g/(kg·d))was thought to be the most appropriate.

Zophobsmorioprotein hydrolysates;KM mice;learning and memory abilities;anti fatigue ability

2014-11-13

王南溪(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲資源開發(fā)與利用。

*通訊作者:楊偉(1964-)，男，博士，教授，研究方向：森林保護學。

四川農(nóng)業(yè)大學“211”工程雙支計劃項目(00370101)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)05-0356-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.067