王洪建

(濮陽市人民醫(yī)院血液病研究所 河南濮陽 457000)

兒童呼吸道病毒感染是兒科患者中最常見的疾病，發(fā)病急、感染重，兒童多不能自述。為指導(dǎo)臨床合理用藥，需要一種快速簡便準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法進(jìn)行診斷［1］。本次研究針對(duì)以上特點(diǎn)，希望找到一種臨床可快速診斷的簡易方法，更好服務(wù)于患者與臨床。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 選取2014年1月至2014年7月在濮陽市人民醫(yī)院兒科病區(qū)住院的1 516例呼吸道感染兒童患者，其中男性682例，女性834例，年齡3個(gè)月～13歲，平均(2.5±0.3)歲。

1．2 檢測(cè)試劑 九項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM抗體檢測(cè)試劑為西班牙VIRCELL公司進(jìn)口產(chǎn)品，購自鄭州安圖生物科技有限公司。

1．3 檢測(cè)方法

1．3．1 標(biāo)本處理 采集患者空腹靜脈血2.0 ml，分別取15μl血清和15μl PBS液加入1.5 ml塑料安瓿管中，震蕩充分混勻。用抗人球蛋白IgG吸附劑150μl加入30μl混合液中，徹底混勻，處理后的血清3 000 r/min離心15 min，除去沉淀。

1．3．2 操作過程 在載玻片的九孔中每孔加15μl吸附劑處理過的血清標(biāo)本。在1個(gè)載玻片加入15μl陽性對(duì)照，另1個(gè)加15μl陰性對(duì)照。將載玻片放濕盒37℃溫育1 h以上。用PBS洗液緩慢來回沖洗3次以上，避免直接對(duì)標(biāo)本孔沖洗，然后浸泡在足量PBS液中放置搖床輕搖10 min。取出用蒸餾水緩慢水流沖洗。載玻片自然風(fēng)干后每孔加入15μl FITC結(jié)合物溶液，將載玻片放入濕盒，37℃溫育30 min。取出載玻片，用PBS洗液緩慢流水沖洗，然后浸泡在PBS中并放置在水平搖床上輕輕搖動(dòng)10 min，自然風(fēng)干，加適量封片介質(zhì)，小心蓋上載玻片。最后用熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司的CX22熒光顯微鏡)在400倍放大率下觀察結(jié)果。

1．3．3 結(jié)果判斷 陽性結(jié)果:可以觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒的整個(gè)包被孔中有3%～15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光(在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時(shí)觀察到著色的合胞);軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的菌體呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光;支原體出現(xiàn)細(xì)胞外圍蘋果綠色熒光。陰性結(jié)果:可觀察到軍團(tuán)菌、肺炎支原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

1．3．4 注意事項(xiàng) 嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作說明書操作，PBS洗液需要事先配置，搖勻直至充分溶解，配好后儲(chǔ)存2～8℃?zhèn)溆茫? d內(nèi)用完，有沉淀?xiàng)壢ブ嘏?。觀察結(jié)果要快速，需要有專人審核復(fù)檢，以免誤判誤認(rèn)，結(jié)合操作手冊(cè)，建立本實(shí)驗(yàn)室的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1 各種病原體陽性感染率 在1 516例兒童呼吸道感染患者中，總陽性率為35.5%(537/1 516)。各種病原體中陽性率最高為肺炎支原體，占21.2%(321/1 516)，其次為腺病毒6.5%(99/1 516)，呼吸道合胞病毒 4.5%(68/1 516)，副流感病毒 3.3%(50/1 516)。

2．2 混合感染 片中可見2種以上病毒混合感染，多為肺炎支原體合并乙型流感病毒及肺炎支原體合并副流感病毒?；旌细腥韭士蛇_(dá)12.8%(194/1 516)，在陽性病例中占36.1%(194/537)。

3 討論

兒童呼吸道感染屬于兒科常見多發(fā)疾病，由于兒童年齡小，免疫力相對(duì)低下，起病急，尤其1歲以下兒童不能自述體征，往往伴隨高熱、抽搐癥狀，有一定病死率，嚴(yán)重威脅兒童健康。本調(diào)查結(jié)果中，肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒是濮陽地區(qū)急性呼吸道感染的主要病毒病原體，并且有相當(dāng)數(shù)量的患兒合并2種病毒混合感染，然而不同地區(qū)、不同人群可能是不同的。隨著近幾年病毒學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)認(rèn)為各種病毒的總發(fā)病數(shù)有增多趨勢(shì)。因此，明確病原體是有效治療小兒肺炎的首要問題，但小兒肺炎的病原譜非常復(fù)雜。國外對(duì)小兒肺炎的病原體及臨床流行病學(xué)的研究資料較多，發(fā)達(dá)國家主要以病毒為主，其中以呼吸道合胞病毒占首位，細(xì)菌性肺炎以肺炎鏈球菌為主。我國對(duì)小兒肺炎病原學(xué)做系統(tǒng)研究較少，小兒肺炎在臨床上表現(xiàn)輕重不一。因此，病原學(xué)檢查非常重要，有利于早期診斷。研究顯示，瀘州地區(qū)以呼吸道合胞病毒為主［2］。濮陽市人民醫(yī)院收治病例以肺炎支原體感染為主，呼吸道合胞為第3位，與各地報(bào)道的呼吸道病毒檢出率不盡相同，所以各地檢驗(yàn)工作者應(yīng)探索建立本地呼吸道病毒流行譜，熟悉當(dāng)?shù)貎和粑兰膊×餍袪顟B(tài)［3］。

本次九項(xiàng)呼吸道病原體檢測(cè)均為IgM，兒童呼吸道感染后首先出現(xiàn)IgM抗體，通常認(rèn)為在病毒感染1周后出現(xiàn)，7～14 d達(dá)到高峰，表明有近期感染，在血清持續(xù)時(shí)間較短，一般為1～3個(gè)月，因此IgM是近期感染的有效標(biāo)志物。采用間接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道病毒特異性IgM，可以提供呼吸道病毒感染血清學(xué)證據(jù)，分析呼吸道病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)，幫助指導(dǎo)臨床合理用藥［4］。本研究從抽取患者靜脈血到得出檢查結(jié)果共需要大約3 h，時(shí)間短，出結(jié)果較快，基本能夠?yàn)榕R床提供比較及時(shí)的檢驗(yàn)結(jié)果，滿足了臨床需求。

濮陽市人民醫(yī)院兒科為醫(yī)院重點(diǎn)學(xué)科，兒科普通病區(qū)與兒科重癥監(jiān)護(hù)室開放床位400余張，每年冬春季床位仍供不應(yīng)求，臨床對(duì)兒童呼吸道病毒的快速檢測(cè)有迫切要求，細(xì)菌培養(yǎng)雖然為細(xì)菌感染診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其有需數(shù)十小時(shí)培養(yǎng)的基本需求，無法滿足兒科臨床快速診斷、快速治療的要求。如無病原學(xué)診斷結(jié)果，盲目用藥，容易造成誤診、誤治和濫用抗生素現(xiàn)象。近年來由于免疫技術(shù)的發(fā)展，如直接、間接免疫熒光法等標(biāo)記技術(shù)，特別是九聯(lián)檢試劑，檢測(cè)方便快速，符合臨床要求，使病原學(xué)快速診斷成為可能，在臨床診斷上有重要意義［5－6］。

九聯(lián)檢試劑雖然可以同時(shí)檢測(cè)九項(xiàng)病毒，但是兒童呼吸道感染病毒并不能全部檢測(cè)，還需要多種檢驗(yàn)技術(shù)的配合應(yīng)用，才能作出更加合理的診斷，并且該試驗(yàn)必須同時(shí)檢測(cè)九種病毒，醫(yī)生不能面對(duì)患者癥狀分析并單獨(dú)開具某種病毒檢測(cè)，客觀上相對(duì)增加了患者的負(fù)擔(dān)，需要在這方面適當(dāng)改進(jìn)，使這種試劑技術(shù)更好地服務(wù)于臨床，服務(wù)于患者。

［1］ 秦茵茵，吳國鋒，秦笙，等．九項(xiàng)呼吸道聯(lián)檢試劑對(duì)多種呼吸道感染病原體檢測(cè)的臨床意義［J］．中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2012，18(2):124－127．

［2］ 劉春艷，李程．2011年瀘州地區(qū)小兒肺炎感染病原學(xué)調(diào)查［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(9):97 －99．

［3］ 董玉琳．呼吸道病原體九聯(lián)檢在小兒急性呼吸道疾病中的應(yīng)用［J］．中外醫(yī)療，2012，31(33):170，172．

［4］ 王加芬，王鳳秀，鄭媛媛，等．呼吸道病毒特異性IgM檢測(cè)對(duì)兒童呼吸道感染的指導(dǎo)意義［J］．中國免疫學(xué)雜志，2015，(2):257 －260．

［5］ Ray CG，Minnich L L．Efficiency of immunofluorescence for rapid detection of Common respiratory viryses［J］．JClin Microbiol，1987，25:355－357．

［6］ 黃秋琳，許翔，江淑芳，等．直接免疫熒光法對(duì)多種呼吸道病毒檢測(cè)的臨床意義［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5(3):135 －136．