呂曉珮 林妍娉 王羿斐 付開(kāi)強(qiáng) 李偉詩(shī) 王 雨 曹榮峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109)

隨著室內(nèi)裝修的日益普及，甲醛已成為主要的室內(nèi)空氣污染物，其對(duì)健康的影響不容忽視，吸入過(guò)量甲醛會(huì)導(dǎo)致肺炎和肺水腫。PDTC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)，即吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽，是NF-κB 的特異性抑制劑，可以抑制NF-κB的活化，減輕炎癥反應(yīng);同時(shí)也是一種抗氧化劑，可以直接清除自由基和抑制自由基的產(chǎn)生［1］。研究發(fā)現(xiàn)，PDTC 可以抑制NF-κB 介導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征的炎癥反應(yīng)。而PDTC 是否對(duì)甲醛引起的肺急性炎癥也有抑制作用，其對(duì)肺組織MPO(Myeloperoxidase)與NO(Nitric oxide)的作用機(jī)理等問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 54 只8～12 周齡成年小白鼠，雌雄各半，購(gòu)于青島市藥品檢驗(yàn)所。置于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，供應(yīng)充足的飲水與食物。

1.1.2 試驗(yàn)試劑與儀器 MPO 檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20140506)，NO 檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，甲醛溶液(Sigma 公司)，PDTC(碧云天生物技術(shù)研究所)，722G 可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，T18 basic 高速分散機(jī)(德國(guó)IKA 公司)，酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)，100 μl 微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠急性肺損傷模型的建立 將30 只雌雄各半的小鼠隨機(jī)分成5 組，每組6 只，分別滴鼻PBS稀釋的不同劑量的甲醛(0、2.5、5.0、10.0 和20.0 mg)溶液20 μl，7 h 后取小鼠肺臟，稱(chēng)重，按質(zhì)量體積比加入9 倍體積的PBS 溶液，分散機(jī)攪拌制作組織勻漿，離心取上清。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)該組織中MPO 的活力及NO 的濃度。根據(jù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，確定小鼠急性肺損傷模型建立的條件。

1.2.2 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響 將24 只雌雄各半的小鼠隨機(jī)分成4 組，每組6只，分別為對(duì)照組、甲醛組、PDTC 組和PDTC +甲醛組。首先對(duì)PDTC+甲醛及PDTC 組腹腔注射100 mg/kg 的PDTC 溶液0.2 ml，1 h 后，甲醛組以及PDTC+甲醛組分別滴鼻10.0 mg 甲醛(模型篩選出的甲醛劑量)溶液20 μl，對(duì)照組和PDTC 組分別滴鼻PBS 溶液20 μl。7 h 后取小鼠肺臟，稱(chēng)重，按質(zhì)量體積比加入9 倍體積PBS 溶液，分散機(jī)攪拌制作組織勻漿，離心取上清。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)該組織中MPO 的活力及NO 的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)資料用SPSS13 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 甲醛誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型的建立

2.1.1 不同劑量甲醛刺激后小鼠肺臟MPO 活力的變化 不同劑量甲醛滴鼻小鼠后肺臟組織MPO 活力的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，隨著甲醛劑量增加MPO 活力呈上升趨勢(shì)，5.0、10.0 mg 甲醛組與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，10.0 mg 甲醛組MPO 活力最高。而2.5 和20.0 mg 甲醛組MPO活力與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

2.1.2 不同劑量甲醛刺激后小鼠肺臟NO 濃度的變化 不同劑量甲醛滴鼻小鼠后肺臟組織NO 濃度的變化結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，隨著甲醛劑量增加NO 濃度呈上升趨勢(shì)，2.5、5.0 和10.0mg 甲醛組與對(duì)照組相比均差異極顯著(P＜0.01)，10.0 mg 甲醛組NO 濃度最高。而20.0 mg甲醛劑量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。

圖1 不同劑量甲醛對(duì)小鼠肺臟MPO 活力的影響Fig.1 Effects of MPO activity in lung tissue of mice with different doses of formaldehyde

圖2 不同劑量甲醛對(duì)小鼠肺臟NO 濃度的影響Fig.2 Effects of NO content in lung tissue of mice with different doses of formaldehyde

2.2 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響

2.2.1 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的MPO 活力的影響 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的MPO 活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3 可以看出，與對(duì)照組相比，甲醛組的MPO 活力極顯著升高(P＜0.01)，PDTC +甲醛組MPO 活力顯著升高(P＜0.05)，PDTC 組無(wú)顯著性變化(P ＞0.05)，說(shuō)明甲醛能顯著升高M(jìn)PO 的活力，單獨(dú)注射PDTC 對(duì)小鼠沒(méi)有顯著影響。與甲醛組相比，PDTC 和PDTC+甲醛組MPO 活力均極顯著降低(P＜0.01)，說(shuō)明PDTC 能顯著降低甲醛誘導(dǎo)的小鼠肺臟MPO 的活力。

圖3 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷MPO 活力的影響Fig.3 Effects of PDTC on activity of MPO by formaldehyde-induced acute lung injury in mice

2.2.2 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的NO濃度的影響 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的NO 濃度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4 可以看出，與對(duì)照組相比，甲醛組的NO 濃度極顯著升高(P＜0.01)，PDTC+甲醛組NO 濃度顯著升高(P＜0.05)，PDTC 組無(wú)顯著變化(P ＞0.05)，說(shuō)明甲醛能顯著升高NO 的濃度，單獨(dú)注射PDTC 對(duì)小鼠沒(méi)有顯著影響。與甲醛組相比，PDTC 與PDTC +甲醛組的NO 濃度均極顯著降低(P＜0.01)，說(shuō)明PDTC 能顯著降低甲醛誘導(dǎo)的小鼠肺臟NO 的濃度。

圖4 PDTC 對(duì)甲醛誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型NO 濃度的影響Fig.4 Effects of PDTC on content of NO by formaldehyde-induced acute lung injury in mice

3 討論

中性粒細(xì)胞聚集在炎癥部位產(chǎn)生MPO，MPO 催化過(guò)氧化氫和氯離子反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸鹽殺滅微生物［2］，且可過(guò)量生成氧化劑導(dǎo)致組織氧化損傷［3］。動(dòng)物炎癥試驗(yàn)多把MPO 含量升高作為炎癥反應(yīng)的標(biāo)志。酵母混懸液誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠肺臟MPO 活力顯著增強(qiáng)［4］，本試驗(yàn)用甲醛刺激小鼠肺臟后，MPO 活力也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明甲醛能夠?qū)е滦∈蠓闻K中性粒細(xì)胞聚集而發(fā)生炎癥反應(yīng)。NO既可殺傷和清除異物，參與機(jī)體的免疫防御活動(dòng)［5］，也可與過(guò)氧化物反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝酸鹽，損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)引起肺組織損傷［6］。高洪波等［7］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肢體缺血/再灌注后所造成的肺損傷中，肺臟NO 濃度顯著增加，這與本試驗(yàn)甲醛誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后NO 濃度顯著增加相一致。所以，我們通過(guò)比較甲醛的劑量和作用時(shí)間，確定了甲醛建立小鼠急性肺損傷的最佳條件。

當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)NF-κB 被激活，活化的NFκB 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游相關(guān)多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子等表達(dá)，引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放大量MPO。NO 主要是由iNOS 合成，iNOS 基因有NF-κB 位點(diǎn)，NF-κB 激活參與iNOS mRNA 的表達(dá)［8］。PDTC 作為NF-κB 的高效抑制劑，通過(guò)阻止IκBα 磷酸化而抑制NF-κB 激活［9］。欒正剛等［10］發(fā)現(xiàn)，PDTC 顯著降低重癥胰腺炎肺損傷的肺組織中MPO 活力和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在甲醛滴鼻前1 h 注入PDTC，也顯著降低了小鼠肺臟中MPO 的活力與NO 的濃度，說(shuō)明PDTC 對(duì)MPO 和NO 的抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB 實(shí)現(xiàn)的。PDTC 同時(shí)具有抗氧化作用，而NO在研究中也常作為氧化指標(biāo)。PDTC 也可能通過(guò)其抗氧化作用清除局部過(guò)剩的氧自由基NO，從而預(yù)防了由于NO 增高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷［11］。

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