郭彩霞，張生萬，李美萍

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

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蘋果及其制品中展青霉素生物防治研究進展

郭彩霞，張生萬，李美萍

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

摘 要：展青霉素是一種由真菌產生的次級代謝產物，普遍存在于腐爛的蔬菜、水果中，特別是蘋果及其制品中。展青霉素具有廣泛的生理及細胞毒性，對人的健康和安全構成了嚴重的威脅。近年來，采用生物防治方法控制蘋果及其制品中展青霉素的污染已成為國際學術界研究的熱點。本文綜述生物防治方法控制蘋果及其制品中展青霉素的研究進展，并論述展青霉素的生物防治機制，為推動生物防治方法在展青霉素控制方面的應用提供參考。

關鍵詞：展青霉素；生物降解；生物吸附；拮抗作用；作用機理

展青霉素（patulin），又叫棒曲霉素，是一種由青霉屬、曲霉屬及絲衣霉屬中多種霉菌或真菌產生的真菌毒素，能致癌、致畸、致突變且具有廣泛的生理及細胞毒性[1-2]。展青霉素普遍存在于腐爛的蔬菜、水果中，特別是蘋果及其制品中，給蘋果產業(yè)帶來了巨大的經濟損失，同時對人的健康和安全構成了嚴重的威脅。盡管之前已有研究表明很多方法對展青霉素的控制及去除有一定效果，但是這些方法都未能達到既能有效降低展青霉素含量，又能保持蘋果及其制品品質不變的商業(yè)應用標準。近年來，隨著科學技術的發(fā)展，采用微生物清除食品中真菌毒素的方法已被科學界所關注，尤其是蘋果上的拮抗微生物和利用失活微生物吸附展青霉素已經成為國際學術界研究的熱點，本文將對生物防治展青霉素污染的研究進展進行綜述，以期為微生物方法在食品工業(yè)中展青霉素的控制及應用提供參考。

1　展青霉素概述

1.1結構與性質

展青霉素是一種內酯類化合物，其化學名稱為4-羥基-4H-呋喃（3, 2C）駢吡喃-2（6H）酮，分子式為C7H6O4（圖1），摩爾質量154.1 g/mol[3]。展青霉素為無色晶體，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，但在堿性溶液中生物活性會受到破壞。其熔點為109～110 ℃，在真空中揮發(fā)溫度為70～100 ℃；易溶于水、氯仿、丙酮、乙醇及乙酸乙酯等有機溶劑，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚[4]。

圖1　展青霉素的化學結構式Fig.1 Chemical structure of patulin

1.2毒性

展青霉素對人類健康的危害主要體現(xiàn)在可以引發(fā)一系列急癥、慢性病癥以及細胞水平的病變（表1）。

嚙齒動物展青霉素急性及亞急性中毒常伴有痙攣、肺出血、皮下組織水腫、腎淤血變性、無尿直至死亡。人攝入展青霉素后可引起嘔吐和胃刺激癥狀。1953年日本發(fā)生的奶牛中毒事件，正是由于奶牛飼料受到了展青霉素污染造成的。中毒奶牛的癥狀包括神經麻痹、中樞神經系統(tǒng)水腫及灶性出血。小鼠注射展青霉素后出現(xiàn)皮下組織水腫、腹腔和胸腔積液、腎淤血及變性、明顯肺水腫、呼吸困難、尿量減少，注射處出現(xiàn)水腫、感染、組織壞死。

表1　展青霉素對健康的影響Table 1 Effects of patulin on human health

展青霉素還具有致癌性、致畸性和致突變性。研究人員在進行內酯類化合物致癌性實驗時發(fā)現(xiàn)展青霉素具有致癌性，將展青霉素溶解在生油中，給兩個月的雄性大白鼠皮下注射，最終引起皮下注射部分發(fā)生局部肉瘤。展青霉素對雞胚有明顯的致畸作用，使出殼后的小雞表現(xiàn)外張爪、顱裂、喙畸形、突眼等癥狀。同時，展青霉素還能抑制植物和動物細胞的有絲分裂，有時伴有雙核細胞的形成和染色體紊亂。

展青霉素的細胞毒性作用主要表現(xiàn)在改變細胞膜的通透性，有利于K＋外流，可抑制細胞中大分子物質合成，并能造成細胞中非蛋白質巰基耗竭，導致細胞活性喪失。Riley等[10]研究表明使用展青霉素對LLC-PK1細胞進行短暫的處理，其毒性作用是不可逆的。

1.3展青霉素的污染

展青霉素在霉爛的杏、李、桃、梨、香蕉、菠蘿、青梅[14]、蜜瓜、蕃茄、櫻桃、辣椒、葡萄、柿子、黃瓜、胡蘿卜、蕃茄醬、蘋果汁、蘋果醬、葡萄汁[15]、蘋果制品、谷物、糕點及豆科植物[16]、陳的火腿、干香腸等[17]食品中均有發(fā)現(xiàn)。但它對水果及其制品的污染較為嚴重，尤其是蘋果及其制品[18]。

20世紀50年代首次在蘋果中發(fā)現(xiàn)展青霉素，之后世界各國均在蘋果制品中檢出展青霉素[19]。1978年，對芬蘭的166 份蘋果制品抽樣檢測發(fā)現(xiàn)20%～40%的樣品產生展青霉素，其中進口產品中檢出展青霉素的含量為50～690 μg/L[20]。隨后在1979年，美國在威斯康星州路攤零售的蘋果汁40 份中有23 份檢出了展青霉素，含量在10～350 μg/L范圍內，平均含量為50.7 μg/L；在華盛頓地區(qū)檢測的13 份樣品中有8 份檢出展青霉素，含量在44～309 μg/L范圍內[21]。1984年從佐治亞州采集的5 份消過毒的蘋果汁中均檢出展青霉素，含量在244～3 990 μg/L，平均含量1 902 μg/L[22]。之后，澳大利亞、智利、英國、日本、丹麥等國家對水果汁及果醬中展青霉素的污染狀況進行調查，發(fā)現(xiàn)展青霉素不同程度的污染水果汁及果醬[23]。在我國，中國預防醫(yī)學科學院等單位曾對我國各地水果制品中展青霉素的污染情況進行過調查，結果顯示：76.9%水果制品的原汁、原醬等半成品均檢出展青霉素，含量在18～953 μg/kg范圍內，19.6%水果制品的成品檢出展青霉素，含量在4～262 μg/kg范圍內[24]。

1.4展青霉素的限量標準

由于展青霉素對食品的污染及具有的毒性，相關管理機構對食品中展青霉素的限量進行了嚴格規(guī)定。歐洲國家率先規(guī)定食品中展青霉素限量標準為50 μg/L，歐盟除了規(guī)定果汁（特別是蘋果汁及含蘋果汁的酒精飲料）中展青霉素的最高限量為50 μg/L，還規(guī)定固體蘋果產品及其制品中展青霉素的最高限量為25 μg/L，嬰兒及兒童食品中展青霉素的最高限量為10 μg/L（表2）。2004年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S. Food and Drug Administration）規(guī)定濃縮蘋果汁和蘋果清汁中展青霉素的限量標準為50 μg/L。表3為我國對蘋果及相關產品中展青霉素的限量標準（GB 2761—2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》）。與此同時，鑒于展青霉素的毒性及對人類健康的威脅，聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織與世界衛(wèi)生組織聯(lián)合組成的專家委員會對展青霉素的每天最高攝入量制定了一個0.4 μg/kg（以體質量計）的臨時標準來更加嚴格地保障食品安全[2]。

表2　歐盟規(guī)定的食品中展青霉素限量標準Table 2 Maximum allowable limits of patulin in foods stipulated by the European Commission

表3　我國規(guī)定的食品中展青霉素的限量指標Table 3 Chiinnaa’ s maximum allowable limits of patulin in foods

2　展青霉素的生物防治方法

目前，對于展青霉素的控制方法，主要有物理方法、化學方法以及生物方法。其中，物理方法主要采用揀選、清洗、澄清、過濾、吸附、電磁輻射、微波處理以及紫外照射等措施對原料果及受展青霉素污染的蘋果汁進行處理[25-28]。這些方法雖然能夠有效降低展青霉素的含量，但不能完全杜絕。澄清、過濾等方法在去除展青霉素的同時，會引起果汁感官品質和理化性質的變化；而電磁輻射、微波處理以及紫外照射等手段，劑量低不足以完全降解展青霉素，劑量過高會引起果汁營養(yǎng)成分的損失。常用的化學去除方法有氨化作用、高錳酸鉀氧化法、硫化處理、添加有機酸和維生素以及臭氧處理法等措施[29-32]。同樣，這些方法在一定程度上能夠實現(xiàn)對展青霉素的降解，但存在效果不穩(wěn)定，化學物質與展青霉素反應機理和反應后的降解產物不確定等缺點。而且在食品中添加化學添加劑是不被提倡的，在一定程度上影響了食品的天然性。

為了尋求一種安全、有效的真菌毒素清除方法，20世紀60年代，人們開始嘗試著用生物學資源進行真菌毒素的清除。采用微生物清除食品中真菌毒素的方法已被科學界所關注，清除過程包括微生物將毒素代謝為低毒或無毒產物和微生物菌體吸附毒素。因此，微生物去除展青霉素的方法被認為是最有希望取代物理、化學法去除展青霉素的措施。

2.1降解微生物對展青霉素的控制

早在1977年，就有實驗證實酵母發(fā)酵過程中大約有90%的展青霉素被降解[33]。1998年Devegowda等[34]首先發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在體外能夠清除大量真菌毒素。隨后Stinson 等[35]研究結果表明受試的8 株酵母菌種有6 株對展青霉素的降解達到了檢測極限以下，所有8 株菌種對展青霉素的降解率都能達到99%以上。實驗還得出酵母發(fā)酵在將果汁中的展青霉素降解到檢測極限以下的同時，未經酵母處理的果汁中的展青霉素只下降了10%。Coelho等[36]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌（Saccharomy cescerevisiae）在25 ℃條件下培養(yǎng)143 h后，可以降解96%的展青霉素。Moss等[37]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌在無氧發(fā)酵過程中能夠降解展青霉素，而在有氧的環(huán)境中在酵母增殖階段對展青霉素沒有降解作用。Ricelli等[38]從蘋果上分離得到了一株對展青霉素具有生物降解作用的氧化葡萄糖酸桿菌。Fuchs等[30]研究了30 種不同來源的乳酸菌對展青霉素的降解作用，并篩選出一株雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis），對展青霉素的去除率可以達到80%。Raffaello等[39]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌Rhodosporidium kratochvilovae strain LS11能夠降解展青霉素，并證明這個過程是微生物降解過程。

2.2拮抗微生物對展青霉素的控制

研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌和乳酸菌對展青霉素的降解作用只適合于發(fā)酵產品中，并不適用于水果上展青霉素的控制，具有一定的局限性。近年來，拮抗微生物作為一種有效控制水果上真菌毒素的技術手段日益受到關注。

Levy等[40]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母（Pichia membranifaciens）和擲孢酵母（Sporobolomyces roseus）在體外能夠降解展青霉素。Castoria等[41]也發(fā)現(xiàn)粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）和羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）等生物防治酵母能夠在體外培養(yǎng)環(huán)境下降解展青霉素。國外還將上述拮抗酵母的研究成功應用于水果上展青霉素的控制。例如，Morales等[42]研究在冷藏條件下（1 ℃）清酒假絲酵母菌（Candida sake）能夠降低蘋果上青霉病的發(fā)生率，同時還能抑制展青霉素的積累；Tolaini等[43]報道羅倫隱球酵母菌（Cryptococcus laurentii）在實驗室條件及半商業(yè)貯藏條件下能夠抑制擴展青霉素的生長以及展青霉素的產生?？梢娊陙磙卓菇湍妇鷮τ诳刂撇珊笏『罢骨嗝顾氐陌l(fā)生取得了巨大的成就，拮抗酵母菌不僅能夠抑制病原菌的生產，同時還能分解真菌毒素和抑制毒素的產生。

2.3失活微生物對展青霉素的控制

目前，能夠用于發(fā)酵降解展青霉素的產品非常有限，微生物降解展青霉素在蘋果汁體系中的推廣應用受到極大的限制。而失活微生物細胞吸附劑因其吸附效果好、潛在生物危害小、使用更安全等優(yōu)點，具有非常廣闊的應用前景和工業(yè)化利用價值[44-45]。因此，有學者研究利用失活微生物去除蘋果汁中展青霉素的污染。

2011年，Yue Tianli等[46]研究發(fā)現(xiàn)利用失活的蘋果酒釀酒酵母能夠成功降低蘋果汁中展青霉素的含量，最大吸附量可以達到70.28%，并且保證蘋果汁的基本理化指標不變。隨后Guo Caixia等[47]比較了實驗室篩選的具有最高吸附率的失活菌粉和商業(yè)失活酵母菌粉對蘋果汁中展青霉素的吸附性能，結果發(fā)現(xiàn)實驗室自制的失活菌粉吸附性能要優(yōu)于商業(yè)失活酵母粉。同時該團隊的另外一個博士Hatab[48]研究表明失活乳酸菌能夠去除蘋果汁中的展青霉素，并且保證蘋果汁的基本理化指標不變。以上研究將失活微生物成功地應用于蘋果汁中展青霉素的去除過程中，試圖利用生物資源解決食品中真菌毒素污染，以及建立一套消除液體食品中毒素污染的處理方法。

3　展青霉素的生物防治機理

3.1微生物的降解作用

微生物能夠改變毒素分子結構將毒素降解成無毒或者毒性較低的產物，從而達到降低展青霉素含量和毒性的目的。對于微生物對展青霉素的降解機理，國外有很多學者進行了相關的研究。Coelho等[49]在奧默畢赤酵母體外降解展青霉素的研究中發(fā)現(xiàn)，展青霉素含量降低的同時pH值也發(fā)生了改變，從初始pH 4.0降低至pH 3.3，因為展青霉素在pH 2.5～5.5范圍內性質穩(wěn)定不容易分解。由此推斷，展青霉素含量降低不是本身分解的原因，也不是細胞壁的吸附作用所致，而是奧默畢赤酵母的代謝作用[49]。Castoria等[41]研究發(fā)現(xiàn)活酵母菌體能夠具有清除展青霉素的能力，而經高壓蒸汽滅菌的失活菌體卻喪失了清除展青霉素的能力，這說明活體酵母清除展青霉素是通過生物降解作用的，而不是酵母壁的吸附作用。Reddy等[50]研究了美極梅奇酵母菌株（MACH1和GS9）對展青霉素的降解作用，之后采用超聲波破碎酵母細胞后用乙酸乙酯提取，在提取液中未檢測出展青霉素，結果表明展青霉素是被美極梅奇酵母徹底降解了，而不是通過酵母細胞吸收清除的。以上研究排除了微生物細胞對展青霉素的吸附作用，證實活體微生物對展青霉素的去除作用主要是通過代謝降解實現(xiàn)的。

同樣地，Harwig等[51]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在蘋果汁中發(fā)酵14 d后能夠將展青霉素完全降解。如果將釀酒酵母濾除，并在濾液中添加展青霉素，之后蘋果汁中展青霉素的含量沒有明顯變化，結果顯示降低展青霉素的是活體釀酒酵母，而不是酵母發(fā)酵的代謝產物。Sumbu等[52]報道釀酒酵母發(fā)酵可在2 周之內將蘋果汁中的展青霉素降解到檢測極限以下，而未經釀酒酵母處理的蘋果汁中的展青霉素在同樣時間內只下降了10%，如果將已發(fā)酵果汁中的酵母過濾掉，展青霉素含量在該蘋果汁中得不到明顯降低，說明對展青霉素起降解作用的是活體酵母，而不是酵母發(fā)酵后的代謝產物。如果進一步在酵母發(fā)酵的過程當中添加一種酵母蛋白質合成阻滯劑——環(huán)己酰胺（cyclohexamide），將完全阻止酵母蛋白質的合成并影響展青霉素的降解。在展青霉素添加3 h之后再添加環(huán)己酰胺，盡管展青霉素還能繼續(xù)被酵母降解，但是其降解速率呈下降趨勢，說明在這3 h內合成的蛋白對展青霉素具有酶催化活性，而不是合成了簡單參與化學反應的反應底物。說明展青霉素的降解是通過活體細胞在發(fā)酵過程中進行的，展青霉素的降解都需要活體酵母，展青霉素的降解是酵母細胞對展青霉素產生的誘導酶的酶促反應作用的結果。

對于微生物降解展青霉素的降解產物，Moss等[37]實驗采用3 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對展青霉素進行降解，經高效液相色譜、薄層層析和核磁共振光譜分析，結果發(fā)現(xiàn)降解過程中會產生兩種主要物質：一種是E-ascladiol，展青霉素合成的直接前體物質；另一種則是它的異構體Z-ascladiol。Ricelli等[38]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）在降解展青霉素的過程，4 h之內80%的展青霉素轉化成E/Z-ascladiol，隨著時間的延長E/Z-ascladiol量不斷減少，形成一種新的產物Hydroascladiol。Raffaello等[39]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌Rhodosporidium kratochvilovae strain LS11在降解展青霉素的過程中形成另外一種低毒性的產物Desoxypatulinic acid（圖2）。并推斷，菌種之間的差異導致降解途徑存在一定的差異性，其降解產物也不相同。

圖2　展青霉素降解產物Fig.2 Degradation products of patulin

3.2微生物的拮抗作用

目前研究發(fā)現(xiàn)，粘紅酵母、畢赤酵母和羅倫隱球酵母等酵母在水果采后病害生物防治上已經表現(xiàn)出良好的生物防治效果，并能夠有效降低蘋果上展青霉素積累量。對于其防治機理，研究人員普遍認為是通過與病原菌的營養(yǎng)和空間競爭，分泌抗菌性物質來抑制病害的發(fā)生，通過抑制病原菌來降低展青霉素的產生及積累。Sharma等[53]研究發(fā)現(xiàn)酵母拮抗菌能夠迅速生長，與病原菌爭奪如碳水化合物、氮源等營養(yǎng)物質，同時占領全部空間，使得病原菌得不到合適的營養(yǎng)與空間，從而抑制病原菌的生長以及病害的發(fā)生。Chan Zhulong等[54]研究白色隱球酵母（Cryptococcus albidus）和拮抗菌膜醭畢赤酵母（Pichia membranefaciens）對采后蘋果3 種病害的防治效果，結果發(fā)現(xiàn)酵母拮抗菌分泌細胞壁水解酶活性與酵母菌對該種病原菌在果實上的抑菌效果呈正相關。酵母拮抗菌還能誘導產生相關蛋白（pathogenesis related protein）如幾丁酶和β-1,3-葡聚糖酶的表達及抗性酶的生成，從而增強了酵母拮抗菌對病原菌的抗性機制。例如異常畢赤酵母（Pichia anomala）和膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）能產生毒性蛋白對病原真菌進行抑制[55-56]。

3.3細胞壁的物理吸附作用

微生物能夠將展青霉素吸附到細胞壁上形成復合物，從而達到降低毒素的目的，研究表明這種物理吸附作用與細胞壁成分有密切關系。Guo Caixia等[57]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌有去除展青霉素的能力，并且利用物理、化學、酶等不同手段處理細胞壁上的多糖、脂質和蛋白質，結果發(fā)現(xiàn)經過處理多糖和蛋白質后的菌體能夠增加吸附能力。由此推斷，細胞壁上的多糖和糖蛋白是細胞壁上起主要作用的成分。同時發(fā)現(xiàn)該吸附是一個可逆過程，經不同洗脫劑對菌體洗脫后，分析發(fā)現(xiàn)不同洗脫劑能不同程度地從吸附毒素的菌體上解析展青霉素，并且乙酸乙酯可以解析近50%的毒素，這個結果再次說明酵母菌對展青霉素的去除作用是物理吸附。Hatab等[48]利用乳酸菌對展青霉素進行去除，并且利用紅外光譜儀分析其機理，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌是通過細胞壁上的肽聚糖對展青霉素進行吸附的。

4　結 語

近年來，國內外食品安全負面事件的頻繁發(fā)生導致全社會對食品安全的關注程度不斷提升。其中蘋果及其制品中展青霉素的污染不僅對人的身體健康產生嚴重的威脅，而且也成為我國水果及其制品出口創(chuàng)匯的技術壁壘。因此，安全有效地將展青霉素降低到對人體有害的極限以下，已成為當今世界蘋果產業(yè)快速、健康發(fā)展的關鍵問題之一。傳統(tǒng)控制展青霉素的方法，如物理、化學方法，不僅不能完全杜絕展青霉素的污染，而且還會引起蘋果及其制品感官品質和理化性質的變化。與傳統(tǒng)方法相比，生物防治方法由于采用特定微生物對展青霉素進行去除，成本低、操作簡單、效果顯著，是一種發(fā)展前景十分廣闊的新型污染物處理方法。目前國內外對有關微生物去除展青霉素的研究，大多集中在微生物對展青霉素降解的體外實驗，關于利用拮抗微生物以及失活微生物去除展青霉素的研究在近幾年剛剛起步。而且有關微生物去除展青霉素機理方面的研究較少，不能系統(tǒng)全面地解讀微生物清除展青霉素的作用方式，從而制約了生物防治技術在水果及其制品中展青霉素控制上的應用。因此，未來的研究工作應該主要集中在生物防治機理方面的研究，用分子生物學手段獲得降解展青霉素的酶等物質的表達基因，尋找對展青霉素具有吸附作用的物質，并通過純化或化學合成得到高效吸附展青霉素的物質，最終將其應用于食品生產過程中，有效控制食品中真菌毒素的污染。

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Recent Progress in Research Biological Control of Patulin Contamination in Apple and Its Products

GUO Caixia, ZHANG Shengwan, LI Meiping
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract:Patulin, a secondary metabolite produced by fungi, frequently occurs in rotten vegetables and fruits, especially in apple and apple products. Patulin has extensive physiological and cytological toxicity, and constitutes a serious threat to people’s health and safety. In recent years, biological control of patulin in apple and its products has become a hot topic among international researchers. In this article, the methods and mechanisms for biological control of patulin contamination are reviewed.

Key words:patulin; biodegradation; bioadsorption; antagonism; mechanism

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507051

中圖分類號：TS201.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0283-06

作者簡介：郭彩霞（1984—），女，講師，博士，研究方向為食品安全與生物技術。E-mail：guocx@sxu.edu.cn

基金項目：山西大學引進人才建設項目（011351801001）

收稿日期：2014-04-16