呂建華+李宏+薛智權(quán)

摘 要：通過(guò)在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中額外添加碳氮源，研究不同碳氮源對(duì)熱帶假絲酵母菌株GY8降酚性能的影響，從而對(duì)該菌株培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，通過(guò)添加額外的碳源和氮源均可促進(jìn)熱帶假絲酵母菌株GY8的生長(zhǎng)。采用的不同碳源中，最適碳源為甲醇，其最適濃度為4 g·L-1。采用的不同氮源中，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更加有利于熱帶假絲酵母菌株GY8對(duì)苯酚的降解。有機(jī)氮源中，酵母膏比蛋白胨更有益于菌株GY8對(duì)苯酚的降解，其最適濃度為0.5 g·L-1。

關(guān)鍵詞：熱帶假絲酵母；苯酚和酚類化合物；生物降解

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.009

Abstract：In this paper， the optimum medium condition for phenol degradation property of Candida tropicalis GY8 was investigated by augmenting the inorganic salt medium with different carbon and nitrogen sources. The results showed that additional carbon and nitrogen sources in medium can promote Candida tropicalis GY8 growth. Among the different carbon sources， the optimum carbon source was methanol， and the optimum concentration was 4 g·L-1. The organic nitrogen sources were significantly conductive than inorganic nitrogen sources to Candida tropicalis GY8 removing phenol. Moreover， yeast extracted had better effect on GY8 to degrade phenol than peptoneamong organic nitrogen sources. 0.5 g·L-1of yeast extracted was optimum for maximum phenol removal.

Key words： Candida tropicalis； phenol and phenolic compounds； biodegradation

由于芳香族化合物的毒性及其所致疾病的難治性，其生物降解受到了許多行業(yè)研究人員的高度重視。苯酚作為最常見(jiàn)的芳香族化合物之一，廣泛存在于諸如煤氣化、焦炭生產(chǎn)、醫(yī)藥、農(nóng)藥、肥料、染料制造、化學(xué)合成、紙漿和造紙等行業(yè)的廢水中，其含量可以高達(dá)6 g·L-1 [1-2]。高濃度的苯酚已被用作一般的消毒劑，對(duì)生物有機(jī)體有毒。1 mg·L-1或以上濃度的苯酚就會(huì)對(duì)水生生物造成影響。即使在相對(duì)低濃度的情況下，其對(duì)微生物也具有毒性（特別是未馴化的微生物）。另外，苯酚可對(duì)將它作為生長(zhǎng)底物進(jìn)行代謝的那些物種產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制[3]。

微生物分解有機(jī)物一般利用有機(jī)污染物作為碳源，但同時(shí)也需要其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽和水。研究表明，某些異生物質(zhì)化合物的降解率可以通過(guò)增加額外的碳源或其他營(yíng)養(yǎng)化合物如氮?dú)?、磷酸鹽以及礦物成分等而得到提高。一些常規(guī)的碳源，如葡萄糖、谷氨酸鈉和酵母提取物等已被用于促進(jìn)對(duì)有毒化學(xué)品的降解[4-9]。Yu 和 Ward[10]報(bào)道，五氯苯酚（PCP）的降解速率和降解程度在加入葡萄糖和蛋白胨后均顯著增加。Topp和Hanson[11]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可刺激細(xì)胞活力和五氯苯酚的降解。Kotresha和Vidyasagar[12]報(bào)道，低濃度的葡萄糖和蛋白胨可以增強(qiáng)綠膿假單胞菌對(duì)苯酚的降解。這些結(jié)果表明，加入一些常規(guī)的碳源和氮源可以幫助減少異生物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性和生長(zhǎng)抑制，從而增加異生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。另外，常規(guī)碳源還可以為有機(jī)化合物的降解提供還原力[13]，或在某些情況下，作為生物降解酶的誘導(dǎo)劑[7]。

目前，在城市污水生物脫氮處理中，經(jīng)常需要額外添加碳源。甲醇、乙酸鈉是最常用的外加碳源[14]。在本研究中，利用各種碳源和氮源營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)對(duì)高效降酚真菌GY8進(jìn)行生物刺激，以找出最佳的營(yíng)養(yǎng)源，協(xié)同降解苯酚，從而為GY8菌治理含酚廢水提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來(lái)源 降解苯酚菌株Candida tropicalis GY8篩選自山西省太谷縣污水處理廠曝氣池的污水樣品，由本實(shí)驗(yàn)組保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20，馬鈴薯浸粉3，瓊脂粉15，pH值自然，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素。

PDB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10，馬鈴薯粉5，葡萄糖15，NaCl 5，pH值自然，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：K2HPO4 0.4，KH2PO4 0.2，NaCl 0.1，MgSO4 0.1，MnSO4·H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，（NH4）2SO4 0.4，加水定容，121 ℃，高壓滅菌20 min，冷卻后加入終濃度為0.025 g·L-1的氯霉素，苯酚根據(jù)需要量加入。

1.2 方 法

1.2.1 菌株Candida tropicalisGY8活化 將保存菌株GY8在PDA固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。從PDA培養(yǎng)板挑取活化的單克隆菌，接種到滅菌的含PDB培養(yǎng)基的試管中，28 ℃，150 r·min-1，培養(yǎng)2 d后作為后續(xù)試驗(yàn)使用菌株。

1.2.2 不同碳源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響 在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入碳原子含量相同的葡萄糖、甲醇和乙酸鈉作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，用4-氨基安替比林分光光度法測(cè)定苯酚濃度[15]，計(jì)算苯酚降解率。苯酚降解率=（未接種前培養(yǎng)液中苯酚含量-培養(yǎng)結(jié)束殘余苯酚含量）/未接種前培養(yǎng)液苯酚含量×100%。用分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定48 h的光吸收度值，表示該菌體生長(zhǎng)量，確定最適碳源。

1.2.3 不同氮源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的氮源分別用與原培養(yǎng)基氮含量相同的氯化銨、蛋白胨和酵母膏替代，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，測(cè)定苯酚降解率和48 h的菌體生長(zhǎng)量，方法同1.2.2，確定最適氮源。

1.2.4 不同濃度的最適碳源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響 根據(jù)1.2.2的試驗(yàn)結(jié)果，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入碳含量為4，8，12，16 g·L-1甲醇作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，測(cè)定苯酚降解率和48 h的菌體生長(zhǎng)量，方法同1.2.2，確定最適碳源的最佳濃度。

1.2.5 不同濃度的最適氮源對(duì)GY8菌株降酚性能的影響 根據(jù)1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加0.5，1，2，5，10 g·L-1的酵母膏作為氮源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24， 48 h，測(cè)定苯酚降解率和48 h的菌體生長(zhǎng)量，方法同1.2.2，確定最適氮源的最佳濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響

在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別以葡萄糖、甲醇和乙酸鈉作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同碳源對(duì)GY8菌株降酚性能的影響如圖1和圖2。

從圖1可以看出，培養(yǎng)48 h后，4種培養(yǎng)基中菌體濃度都在增長(zhǎng)，其中，加乙酸鈉的培養(yǎng)基中菌體增長(zhǎng)最多，其次為甲醇、葡萄糖，無(wú)外加碳源的培養(yǎng)基中菌體增長(zhǎng)最少。該結(jié)果表明，外加碳源均可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。

從圖2可以看出，培養(yǎng)8，24 ，48 h后，碳源為甲醇時(shí)培養(yǎng)基中的菌對(duì)苯酚降解速度最快，當(dāng)碳源為葡萄糖或乙酸鈉時(shí)，在培養(yǎng)8 h時(shí)對(duì)GY8菌降解苯酚有一定的促進(jìn)作用，但在培養(yǎng)24和48 h后，對(duì)GY8菌降解苯酚具有抑制作用。這可能是由于在培養(yǎng)初期，葡萄糖和乙酸鈉可以增強(qiáng)GY8菌對(duì)苯酚毒性的抵抗性，增加微生物的活性，從而提高對(duì)毒害有機(jī)物質(zhì)的處理效果[16-17]。KaiChee和Wang研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖后，培養(yǎng)基pH值由7.2降至4.3，從而導(dǎo)致4-氯酚降解率降低。當(dāng)在葡萄糖存在時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，可以增強(qiáng)苯酚和4-氯酚降解率，并且可實(shí)現(xiàn)苯酚和4-氯酚的完全降解[18]。本研究在培養(yǎng)后期，GY8菌可能會(huì)代謝葡萄糖和乙酸鈉產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)基pH值降低[19]，抑制苯酚降解酶的活性。圖2的結(jié)果表明，甲醇對(duì)于GY8菌株生長(zhǎng)是最有利的，因而增強(qiáng)了菌株對(duì)苯酚的降解能力，因此是最佳的碳源。

2.2 不同氮源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的氮源分別用與原培養(yǎng)基氮含量相同的氯化銨、蛋白胨和酵母膏替代，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同氮源對(duì)GY8菌株降酚性能的影響如圖3和圖4所示。

由圖3和圖4可以看出，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中不同的氮源會(huì)明顯影響到菌株的生長(zhǎng)以及苯酚的最終降解率。其中，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中氮源為酵母膏時(shí)，GY8菌株的生長(zhǎng)速度及對(duì)苯酚的降解效果最佳，蛋白胨次之，然后是硫酸銨和氯化銨。該結(jié)果說(shuō)明，有機(jī)氮源對(duì)于菌株的生長(zhǎng)及苯酚的降解均優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。在有機(jī)氮源中，由于酵母膏含有谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、麥角甾醇等生長(zhǎng)刺激因子，因而可促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，而蛋白胨可能會(huì)抑制菌株苯酚降解酶分泌[20-22]，故酵母膏對(duì)菌株降解苯酚的效率優(yōu)于蛋白胨。

2.3 不同濃度的最適碳源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響

在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入碳含量為4，8，12，16 g·L-1甲醇作為培養(yǎng)基的碳源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同含量的最適碳源對(duì)GY8菌株降酚性能的影響如圖5和圖6。

由圖5可以看出，培養(yǎng)48 h后，4種培養(yǎng)基中菌體濃度都在增長(zhǎng)，其中，甲醇濃度為4 g·L-1和8 g·L-1的樣品菌體增長(zhǎng)較多，兩組增長(zhǎng)情況無(wú)顯著差異；甲醇濃度為12 g·L-1和16 g·L-1的樣品菌體增長(zhǎng)較少，兩組增長(zhǎng)情況無(wú)顯著差異。

從圖6可以看出，甲醇濃度為4 g·L-1的樣品中的菌降解速度最快，隨著甲醇濃度升高，GY8降解苯酚的速率依次降低，這可能是隨著外加碳源濃度的加大，菌株會(huì)優(yōu)先利用外加碳源，從而對(duì)苯酚的利用降低。另外，高濃度甲醇可能會(huì)對(duì)菌產(chǎn)生毒性作用，從而抑制菌株的生長(zhǎng)[23]。

2.4 不同濃度的最適氮源對(duì)菌株GY8降酚性能的影響

在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入氮含量為0.5，1，2，5，10 g·L-1酵母膏作為培養(yǎng)基的氮源，培養(yǎng)基中的苯酚濃度為1.0 g·L-1，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（150 r·min-1，28 ℃）中培養(yǎng)8，24，48 h，不同含量的最適氮源對(duì)GY8菌株降酚性能的影響如圖7和圖8所示。

由圖7可以看出，無(wú)論酵母膏的濃度是多大，都會(huì)促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)。從圖8可以看出，不同濃度的酵母膏對(duì)苯酚的降解率是有一定影響的，酵母膏濃度越高，苯酚降解率越低，當(dāng)酵母膏的濃度為0.5 g·L-1時(shí)，苯酚降解率達(dá)到最大值。該結(jié)果表明，低濃度的氮源更利于苯酚的降解。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同的碳氮源，觀察熱帶假絲酵母菌株GY8的降酚活性，來(lái)確定該菌株的最適碳源和氮源。結(jié)果表明，通過(guò)添加額外的碳源和氮源均可以促進(jìn)菌株GY8的生長(zhǎng)。不同碳源中，最適碳源為甲醇，甲醇濃度為4 g·L-1時(shí)，苯酚降解率最大。不同氮源中，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于熱帶假絲酵母菌株GY8對(duì)苯酚的降解，而有機(jī)氮源中酵母膏的效果優(yōu)于蛋白胨。酵母膏濃度為0.5 g·L-1時(shí)，苯酚降解率達(dá)到最大。本研究為將GY8菌株應(yīng)用于含酚廢水的治理提供了理論基礎(chǔ)。

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