陳文拴，黃乾明,*，陳華萍，楊澤身，王安逸，蘇光燦

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

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油橄欖苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

陳文拴1，黃乾明1,*，陳華萍1，楊澤身2，王安逸2，蘇光燦2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

摘 要：采用同源克隆、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcript ion polymerase chain reaction，RT-PCR）、融合引物嵌套PCR（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）與3’-cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA end，RACE）技術(shù)相結(jié)合，從 油橄欖（Olea europaea）中克隆得到苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）基因全長，命名為OePAL。序列分析表明，OePAL的DNA全長2 970 bp（GenBank登錄號KJ511867），含一個內(nèi)含子（393～1 220 bp）；全長cDNA有2 142 bp（GenBank登錄號KJ511868），開放閱讀框編碼713 個氨基酸，與其他植物有較高的同源性。利用該基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZα A-OePAL， 且在畢赤酵母X33中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測顯示該重組酶的分子質(zhì)量在77.5 kD左右，純化后的酶比活力為196.3 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該重組酶的最適反應(yīng)條件為40 ℃，pH 8.8；在供試范圍內(nèi)Cu2+與Na+可以提高該酶活性；以L-苯丙氨酸為底物，在最適條件下該酶的Km為4. 89×10－4mol/L。結(jié)果表明成功地克隆到OePAL，構(gòu)建了表達(dá)載體，并進(jìn)行了功能驗證。

關(guān)鍵詞：苯丙氨酸解氨酶；基因克?。槐磉_(dá)載體；畢赤酵母X33

油 橄欖（Olea europaea）屬于木犀科、木犀欖屬，是著名的木本油料樹種[1-2]，其果實主要用來壓榨生產(chǎn)有“液體黃金”之稱的橄欖油，橄欖油具有多種藥用與保健功效[3-4]，隨著人們對健康的日益關(guān)注，近幾十年來油橄欖產(chǎn)品呈現(xiàn)節(jié)節(jié)攀升的景象。橄欖油之所以能發(fā)揮多種藥理作用，與其所含的黃酮類物質(zhì)有很大關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)黃酮具有抗氧化、抗自由基、改善心血管系統(tǒng)與防癌等多種藥理作用[5-7]，因此富含黃酮的橄欖油具有極好的藥理價值。此外，黃 酮類化合物對植物體本身也具有多種生物學(xué)功能，如參與影響植物花朵和果實顏色的形成，在植物的多種逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的抗逆作用[8-10]。因此黃酮類化合物一直都是植物次生代謝物研究中的熱點。

黃酮類化合物 是苯丙氨酸代謝途徑中的次生代謝物，該途徑由苯丙氨酸解氨酶（phenylalan ine ammonia lyase，PAL）催化L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）脫去氨基生成肉桂酸開始，后經(jīng)一系列不同酶的催化進(jìn)入不同的分支[11]。PAL是該途徑中的第一個酶，且又是關(guān)鍵酶，其活性與黃酮類物質(zhì)的合成有著密切的關(guān)系[12]。在逆境脅迫條件下的研究發(fā)現(xiàn)，植 物PAL活性的變化與其遭受的脅迫因素有緊密的聯(lián)系，因此PAL可以作為植物抗逆性的一個生理指標(biāo)[13]。目前已從多種植物中分離出了該酶的基因，研究發(fā)現(xiàn)植物PAL屬于多基因家族，且可以分成不同的亞族，如在煙草的4 個PAL中，PAL1與PAL2屬于同一亞族，而PAL3與PAL4同屬另一亞族[14]。植物PAL編碼區(qū)的長度大多在2 100 bp左右，如水稻PAL的開放閱讀框（open reading frame，ORF）長2 151 bp[15]，苜蓿PAL1的ORF長2 175 bp[16]。在大腸桿菌中進(jìn)行的異源表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，不同來源PAL表達(dá)產(chǎn)物的比活力有很大差異，如純化后的重組膜莢黃芪PAL比活力為6 500 U/mg[17]，而重組苦蕎PAL則為158.74 U/mg[18]，這可能與不同植物PAL之間的差異有密切的關(guān)系。在合適的條件下，PAL能逆向催化肉桂酸加氨生成可以作為食品醫(yī)藥工業(yè)原料的L-Phe，目前雖已將紅酵母（Rhodotorula glutinis）PAL應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但存在活性低、穩(wěn)定性差等突出問題，限制了L-Phe工業(yè)的生產(chǎn)[19]。因此，對不同來源PAL的研究，將會為篩選更合適的工業(yè)級PAL酶源提供廣闊的空間。鑒于PAL在植物黃酮代謝和逆境脅迫中所發(fā)揮的重要作用，以及在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用價值，本研究從油橄欖中克隆出PAL的全長，且實現(xiàn)該基因在畢赤酵母X33中的分泌表達(dá)，并進(jìn)行了相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)分析，以期為后續(xù)進(jìn)行的以性狀改良為目的的分子輔助育種提供基因資源，為未來該酶的改良以及在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

油橄欖（Olea europaea）采自西昌涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司北河油橄欖種植基地3 年生配多靈品種的幼嫩葉片。

植物RNA提取試劑盒 天恩澤基因科技有限公司；通用型DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞 Tiangen公司；Premix Taq，Prime STAR?Max DNA Polymerase，pMDTM19-T Vector Cloning Kit， Prime ScriptTMRT Reagent Kit，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、NotⅠ、SacⅠ，Lysis Buffer與T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 康為世紀(jì)公司；實驗中所用引物、ZeocinTMSelection Reagent 美國Invitrogen公司；畢赤酵母X33、質(zhì)粒pPICZα A為本實驗室保存；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

LB、YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的配制均參照Invitrogen公司 畢赤酵母操作手冊。

1.2儀器與設(shè)備

A100/A200型基因擴(kuò)增儀 郎基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；UV-3000型紫外分析儀 上海嘉鵬科技有限公司；Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1 油橄欖總DNA與總RNA的提取及cDNA第一鏈的制備

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取油橄欖葉片中的總DNA[20]。按照植物RNA提取試劑盒內(nèi)說明書上的操作步驟提取油橄欖新鮮葉片中的總RNA。利用提取到的總RNA，參照Prime ScriptTMRT Reagent Kit說明書用引物CDSP（實驗中使用的引物見表1）合成cDNA第一鏈[21]，產(chǎn)物保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1　擴(kuò)增PPAALL所用引物Table 1 Primers for cloning PAL used in this studyy

1.3.2 油橄欖PAL的克隆

根據(jù)同源序列比對與NCBI中收錄的油橄欖PAL的cDNA序列片段（GenBank登錄號JX266201.1）分別設(shè)計擴(kuò)增PAL的上游兼并引物PU與下游特異引物PD，以總DNA為模板擴(kuò)增PAL的DNA片段，對擴(kuò)增到的產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑選陽性克隆提質(zhì)粒后送往上海英濰捷基公司測序。

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計用于步移PAL 5’端未知序列的3條巢式特異引物AP1、AP2與AP3。以總DNA為模板，用特異引物AP1與另設(shè)計的融合有特異引物接頭的隨機(jī)引物FAD 1、FAD2、FAD3和FAD4分別進(jìn)行第一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；98 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 m in，72 ℃ 2 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s；25 ℃ 3 min；72 ℃ 2 min；94℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，2 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，15 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃結(jié)束[22]。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物AP2與FSP1進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃結(jié)束[22]。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物AP3與FSP2進(jìn)行第三輪PCR，反應(yīng)程序同第二輪。對第三輪有明顯條帶的PCR產(chǎn)物回收連接克隆后進(jìn)行測序。

根據(jù)油橄欖PAL的cDNA序列片段設(shè)計擴(kuò)增其3’端未知序列的兩條巢式特異引物ZP1與ZP2。以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，用特異引物ZP1與通用引物UPML 和UPMS（兩者物質(zhì)的量比為1∶5）一起進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)參數(shù)：94℃ 2 min； 94℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃結(jié)束[21]。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物ZP2與通用引物NUP進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃結(jié)束[21]。對第二輪有明顯條帶的PCR產(chǎn)物回收連接克隆后進(jìn)行測序。

將以上擴(kuò)增到的基因片段進(jìn)行拼接，確定PAL的5’端與3’端非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）。在起始密碼子與終止密碼子位置分別設(shè)計用于擴(kuò)增PAL全長且加有酶切位點的上下游引物PS（引入KpnⅠ酶切位點）與PX（引入NotⅠ酶切位點），分別以油橄欖總DNA和cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增PAL的全長DNA和cDNA。

1.3.3 油橄欖PAL的生物信息學(xué)分析

比對基因的DNA與cDNA序列，并結(jié)合GENSCAN在線確定其外顯子、內(nèi)含子以及ORF序列；用NCBI的BLASTn和BLASTp工具分別對基因完整的ORF與推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對；采用SignalP 4.1進(jìn)行信號肽預(yù)測；用NetNGlyc 1.0 Server在線進(jìn)行糖基化位點分析；利用SOPMA在線工具進(jìn)行多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)分析；通過SWISS-MODEL在線預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；用SMART在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析；利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ與NotⅠ對油橄欖PAL的全長cDNA回收產(chǎn)物和pPICZα A質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切處理，純化回收后用T4連接液過夜反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含25 μg/mL Zeocin的LB平板培養(yǎng)基，用PCR鑒定后挑陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定并測序，該正確的表達(dá)載體命名為pPICZα A-OePAL。

1.3.5 酵母菌的轉(zhuǎn)化及篩選

將85 μL新鮮的畢赤酵母X33感受態(tài)與經(jīng)SacⅠ線性化的10 μg左右pPICZα A-OePAL DNA混勻后轉(zhuǎn)入0.2 cm的電擊杯中預(yù)冷5 min，經(jīng)2 kV、4 ms電擊轉(zhuǎn)化后，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇重懸菌體，30 ℃溫育1 h左右，全部涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)2～5 d直至單菌落出現(xiàn)，挑單菌落用Lysis Buffer裂解菌體后PCR鑒定。

1.3.6 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化、檢測

挑選重組畢赤酵母X33/pPICZα A-OePAL接種于50 mL的BMGY培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h左右；用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600 nm在1.0左右，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)，期間每隔24 h添加至終體積分?jǐn)?shù)為1.0%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時進(jìn)行粗酶液活力的測定，待酶活力達(dá)到最大時，離心菌液收集上清液，用組氨酸標(biāo)簽試劑盒純化。另培養(yǎng)畢赤酵母X33/pPICZα A作為陰性對照。表達(dá)產(chǎn)物用7.5%分離膠，4%濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.3.7 重組6×His-OePAL酶活力的測定以及酶學(xué)性質(zhì)分析

將終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.5）與10 mmol/L的L-Phe反應(yīng)混合液3 mL在30 ℃保溫5 min，加入30 μL的純化酶液混勻后測定OD290 nm（對照組以等體積水代替），接著在30 ℃保溫1 h后測定OD290 nm，實驗中以每小時反應(yīng)液在290 nm波長處的光密度增加0.01為1 U[19]。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定酶液中的蛋白質(zhì)含量，計算重組6×His-OePAL的比活力。

溫度對重組酶活力的影響：p H 8.5，分別在20～60 ℃范圍內(nèi)測定酶活力，并計算相對酶活力（以最高酶活力為100%）；將純化酶液分別在0～80 ℃范圍內(nèi)保溫30 min后測定剩余酶活力，以未經(jīng)保溫的酶液作為對照（100%）。

pH值對重組酶活力的影響：在最適反應(yīng)溫度下，分別測定pH 5.0～10.0范圍內(nèi)的酶活力，并計算其相對酶活力（以最高酶活力為100%）；將純化酶液分別在pH 4.0～10.0的不同緩沖液中保溫（最適溫度）30 min后，于最適條件下測定剩余酶活力，以未經(jīng)保溫的酶液作為對照（100%）。

不同金屬離子對重組酶活力的影響：在反應(yīng)體系中加入終濃度為10 mmol/L的Mn2+、Cu2+、Ag+、Co2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Fe2+、Hg2+、Zn2+于最適條件下測定酶活力，以未加金屬離子的反應(yīng)液作為對照（100%）。

重組酶的反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km測定：分別以0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L的L-Phe為底物在最適條件下測定酶活力，利用Lineweaver-Burk作圖法（雙倒數(shù)作圖法）求得米氏常數(shù)Km。

2　結(jié)果與分析

2.1油橄欖PAL的克隆結(jié)果

圖1　油橄欖PPAALL的PCR擴(kuò)增圖CRFig.1 PCR amplification of PAL from Olea europaea

用引物PU與PD的擴(kuò)增產(chǎn)物測序有2 595 bp條帶（圖1a），序列分析表明克隆到了油橄欖PAL片段。用4 種隨機(jī)引物對PAL 5’端進(jìn)行染色體步移，最終只有引物FAD1克隆出一條850 bp的明亮條帶（圖1b），序列分析表明已克隆出包括起始密碼子在內(nèi)的油橄欖PAL 5’端未知序列。3’-cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA end，RACE）的測序結(jié)果表明，已克隆出包括Poly A在內(nèi)的PAL 3’端未知序列（圖1c）。用引物PS與PX擴(kuò)增PAL全長DNA與cDNA分別為3 000 bp與2 200 bp左右（圖1d）。

2.2OePAL的生物信 息學(xué)分析

2.2.1 OePAL的序列分析

圖 22 OOeePPAALL的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotides and deduced amino acid sequences of OePAL

將油橄欖PAL序列在NCBI進(jìn)行提交，命名為OePAL。OePAL全長DN A有2 970 bp（GenBank登錄號KJ511867），包含一段符合典型GT—AG剪切方式的內(nèi)含子（393～1 220 bp）；全長cDNA有2 142 bp （GenBank登錄號KJ511868），包含一個完整的ORF，編碼一條713 個氨基酸的多肽鏈（圖2）。經(jīng)NCBI-BLAST發(fā)現(xiàn)，OePAL的ORF與GenBank中已收錄的茶樹（GenBank登錄號D26596.1）、馬鈴薯（GenBank登錄號KC631948.1）、煙草（GenBank登錄號D17467.1）以及紫蘇（GenBank登錄號JQ277717.1）的相似度較高，均在80%～81%之間；OePAL的氨基酸序列與丹參（GenBank登錄號ABD73282.1）、香蜂草（GenBank登錄號CBJ23826.1）和紫蘇（GenBank登錄號AEZ67457.1）的同源性分別高達(dá)88%、89%、90%。通過Clustalw進(jìn)行多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，在OePAL的第200～211位氨基酸序列之間存在有典型的PAL活性中心特征序列SGDLVPLSYIAG，此外還有4 個作為脫氨位點的氨基酸殘基（L203、V204、L253、A254）和11 個作為催化活性位點的氨基酸殘基（N257、G258、N379、D380、N381、H393、H483、N484、Q485、D486、V487），表明成功克隆到了OePAL。

OePAL的氨基酸序列經(jīng)ProtParam在線分析表明，其分子質(zhì)量為77.514 4 kD，等電點為5.83，含有71 個帶正電荷的氨基酸殘基，83 個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，分子式為C3424H5490N944O1052S25，不穩(wěn)定系數(shù)為36.56，屬于穩(wěn)定性蛋白。SignalP 4.1預(yù)測OePAL氨基酸序列中不含信號肽序列。糖基化位點分析顯示（圖3），當(dāng)閾值為0.5時，該多肽鏈的第1 40、257、445、609位氨基酸可能被糖基化。

圖 33 OOeePAL的糖基化位點分析Fig.3 Glycosylation site analysis of OePAL protein

2.2.2 OePAL蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

OePAL蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析顯示（圖4），其中α-螺旋占56.52%，β-轉(zhuǎn)角占5.61%，無規(guī)則卷曲占30.86%。結(jié)構(gòu)域分析顯示OePAL蛋白中包含一段有496 個（第53～548位）氨基酸殘基組成的具有芳香族氨基酸裂解酶活性的功能域，符合PAL家族蛋白特征。

圖 44 OOeePAL蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Spatial structure analysis of OePAL protein

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖5　不同來源的PPAALL氨基酸序列聚類分析結(jié)果Fig.5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of PAL from different plants

在軟件M E G A 5 . 0平臺上采用最大可能性法（maximum likelihood methods）構(gòu)建基于16 種植物PAL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示（圖5），裸子植物明顯區(qū)別于雙子葉植物和單子葉植物單獨處于一個分支，屬于同一科的植物多處于同一個分支，均符合植物分類學(xué)；紫蘇、地黃、黃芩和油橄欖同處于一個大的分支，表明油橄欖與它們的親緣關(guān)系要明顯近于其他物種。

2.3表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化后篩選

重組質(zhì)粒經(jīng)酶切檢測（圖6）及測序，表明成功構(gòu)建到了pPICZα A-OePAL表達(dá)載體。該線性化載體經(jīng)轉(zhuǎn)化涂板待長出單菌落后，用pPICZα A上的通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定（圖7），結(jié)果挑選出了與目標(biāo)條帶分子質(zhì)量一致的單菌落，表明有OePAL已成功整合到畢赤酵母X33的基因組中。

圖6　重組質(zhì)粒pPICZα AA--OOeePPAALL的酶切鑒定Fig.6 Identification of pPICZα A-OePAL with restriction enzyme digestion

圖7　重組酵母的基因組PCR鑒定Fig.7 Identification of PCR amplified products from recombinant yeast genomic DNA

2.4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測及酶活性分析

圖8　表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE analysis of expressed products

研究溫度對6×His-OePAL活力的影響發(fā)現(xiàn)（圖9a），該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，與百合鱗莖和紅酵母中PAL的最適溫度一致[24-25]，在高于50 ℃條件下保溫30 min后，其活力下降迅速，與山藥、無殼葫蘆籽和鷹嘴豆中PAL的特點相似[26-28]。研究pH值對重組酶活力的影響表明（圖9b），該酶的最適反應(yīng)pH值為8.8，處于大多數(shù)植物PAL的最適pH 8.0～9. 5范圍之內(nèi)[29]，在pH值為7.7～9.2范圍內(nèi)保溫30 min后，其相對酶活力仍可保持在80%以上。考察金屬離子對重組酶活力的影響發(fā)現(xiàn)（圖9c），在供試范圍內(nèi)只有Cu2＋和Na＋對該酶具有激活作用，其

將誘導(dǎo)表達(dá)的粗酶液與純化后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，結(jié)果見圖8，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的陽性轉(zhuǎn)化子比空載對照組在77.5 kD左右處多出一條明顯的條帶，經(jīng)特異純化的蛋白產(chǎn)物僅在該位置處有一明顯條帶，表明目的蛋白已經(jīng)分泌表達(dá)。純化后的重組6×His-OePAL比活力為196.3 U/mg，比純化前提高了6.4 倍，遠(yuǎn)高于提取的油橄欖皮瓜爾品種葉片PAL的比活力（約48.81 mU/mg）[23]，分析原因可能與提取的油橄欖葉片PAL沒有進(jìn)行后續(xù)的純化，粗提液中含有大量的雜蛋白有直接的關(guān)系，此外還可能與油橄欖品種和樹齡的差異有一定關(guān)系。

圖9　重組酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig.9 Enzymatic properties of recombinant enzyme

2.5重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析余8 種金屬離子均表現(xiàn)抑制作用，其中Hg2＋的抑制作用最強(qiáng)，這可能與Cu2＋和Na＋作為輔基與重組酶結(jié) 合后能保持酶蛋白的活性構(gòu)象從而起到激活作用，而Hg2＋與酶分子中的—SH基團(tuán)結(jié)合從而抑制酶的活性有關(guān)。金屬離子對酶活性的影響不僅與金屬離子的濃度有關(guān)，而且還與酶的來源差異性有關(guān)，如對百合鱗莖PAL的研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，Na＋可以從抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用，Mg2＋可以從促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔肹24]，在本實驗中Cu2＋對重組OePAL具有促進(jìn)作用，而苦蕎PAL的原核表達(dá)產(chǎn)物在與本實驗相同濃度的Cu2＋中其催化作用則受到了抑制[18]，因此關(guān)于金屬離子對重組OePAL的影響還有待更深入的研究。利用雙倒數(shù)作圖法求出米氏常數(shù)Km為4.89×10－4mol/L（圖9d），在大多數(shù)PAL的Km（0.3×10－4～1.5×10－2mol/L）范圍內(nèi)偏低[24]。

3 結(jié) 論

在本實驗中成功地克隆出了OePAL全長，序列分析表明，OePAL的編碼序列和翻譯的氨基酸序列與其他物種有較高的同源性。酶切連接構(gòu)建的pPICZα A-OePAL表達(dá)載體成功地轉(zhuǎn)入到畢赤酵母X33中，最終實現(xiàn)了分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測其分子質(zhì)量與預(yù)測的基本一致，經(jīng)測定該重組酶的比活力為196.3 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該重組酶的最適反應(yīng)條件為40 ℃、pH 8.8，熱穩(wěn)定性與pH值穩(wěn)定性研究表明該重組酶不耐高溫、不耐酸與強(qiáng)堿，Cu2＋與Na＋對該重組酶的酶促反應(yīng)有微弱的促進(jìn)作用，酶促反應(yīng)動力學(xué)研究表明該重組酶與L-Phe的親和力較低。

雖然目前對植物中苯丙氨酸代謝途徑比較清楚，但該代謝過程既受其遺傳背景與生長發(fā)育程序的調(diào)控，也受生長環(huán)境中各種誘導(dǎo)因素的刺激，是一個復(fù)雜的動態(tài)過程。在油橄欖中由苯丙氨酸參與主導(dǎo)次生代謝物合成的關(guān)鍵酶與相關(guān)的功能基因和結(jié)構(gòu)基因以及具體的代謝途徑尚有待研究，因此，對OePAL的研究不僅為探究與苯丙氨酸相關(guān)的次生代謝途徑奠定基礎(chǔ)，且為采用分子育種技術(shù)對油橄欖進(jìn)行性狀改良提供了思路。

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Cloning of Phenylalanine Ammonia Lyase Gene from Olea europaea and Its Expression in Pichia pastoris

CHEN Wenshuan1, HUANG Qianming1,*, CHEN Huaping1, YANG Zeshen2, WANG Anyi2, SU Guangcan2
(1. College of Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Liang Shan Zhong Ze New Technology Developme nt Co. Ltd., Xichang 615000, China)

Abstract:The phenylalanine ammonia lyase gene (PAL) was clo ned from Ol ea europaea by homology cloning, RT-PCR, FPNI-PCR (fusion primer and nested integrated PCR) and 3’-RACE, and named as OePAL. Sequencing showed that the full-length DNA of OePAL was 2 970 bp (GenBank, KJ511867) with an intron (393–1 220 bp). Meanwhile, the full-lengt h cDNA of OePAL was 2 142 bp (GenBank, KJ511868). The open reading frame (ORF) of OePAL encoded 713 amino acid residues, and sequence analysis suggested that OePAL had high homology with other botanic PALs. The full-length exon of OePAL expression vector pPICZα A-OePAL was constructed and expressed in Pichia pastoris strain X33. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of recombinant enzyme was approximately 77.5 kD, and the specific activity of purifi ed enzyme was 196.3 U/mg. The enzymatic properties of recombinant 6×His-OeP AL indicated that the optimum reaction cond itions were 40 ℃ and pH 8.8. Ions such as Cu2+and Na+could enhance the enzyme activity within the tested range. The enzyme had a Kmof 4.89 × 10-4mol/L for L-phenylalanine at the optimum reaction conditions. Results indicated that OePAL was amplified and sub-cloned into the vector of pPICZα A, and its function was validated s uccessfully.

Key words:phenylalanine ammonia lyase (PAL); gene cloning; expression vector; Pichia pastoris strain X33

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507023

中圖分類號：Q812

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0124-07

*通信作者：黃乾明（1964—），男，教授，博士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：huangqianming2014@126.com

作者簡介：陳文拴（1988—），男，碩士研究生，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：chenwenshuan@126.com

基金項目：四川省科技廳科技支撐計劃項目（12ZC2220）

收稿日期：2014-06-13