楊 萍，彭吉霞，陳德森，朱克剛

(1． 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

大株紅景天注射液對大鼠心肌缺血預(yù)處理血管內(nèi)皮生長因子的影響

楊 萍1，彭吉霞2，陳德森2，朱克剛2

(1． 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

目的 研究大株紅景天注射液對大鼠急性心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的作用機(jī)制。方法 大鼠24只隨機(jī)分為對照組、模型組、缺血預(yù)處理組。模型組、缺血預(yù)處理組經(jīng)尾靜脈注射垂體后葉素制作大鼠急性心肌缺血模型，分別于造模前、造模1 h及治療1周后采用雙抗體夾心ELISA法測定各組大鼠胎肝激酶1(FLK-1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、VEGF基因及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 缺血預(yù)處理組在造模1 h及治療1周后FLK-1及 FLK-1mRNA、 HIF-1α及 HIF-1α mRNA、VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)明顯增高，與對照組、模型組及同組缺血預(yù)處理前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論大株紅景天注射液可促使急性心肌缺血大鼠缺血心肌血管內(nèi)皮新生，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及損傷程度，對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

大鼠；大株紅景天注射液；心肌缺血預(yù)處理；血管內(nèi)皮生長因子

Key works: rat; Rhodiola crenulate injection; myocardial ischemic preconditioning; vascular endothelial growth factor

冠脈溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、急性心肌梗死、心肌梗死再通術(shù)等疾病和手術(shù)常引起急性心肌缺血再灌注損傷[1],故尋找安全可靠的治療心肌缺血再灌注損傷及缺血預(yù)處理藥物尤其重要。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有增加微小靜脈血管的通透性、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成等作用[2]。紅景天注射液能增加VEGF表達(dá)，具有抗缺氧、抑制過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生[3]、改善冠狀動脈血流、抑制血栓形成的作用，可預(yù)防和治療血管再狹窄及保護(hù)缺血心肌[4]，臨床常用于此類疾病的輔助治療。由于大株紅景天注射液對大鼠缺血心肌血管內(nèi)皮再生的影響及其機(jī)制鮮有臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)經(jīng)尾靜脈注射垂體后葉素制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，采用該注射液對大鼠急性心肌缺血預(yù)處理，系統(tǒng)觀察了其對心肌VEGF表達(dá)的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠24只，鼠齡30～60 d，體質(zhì)量(200±20)g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用許可證號：SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2011-0008。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每天觀察動物進(jìn)食情況，稱體質(zhì)量，及時(shí)清理糞便。采用隨機(jī)數(shù)字表編號將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、缺血預(yù)處理組，每組8只。

1.2儀器及藥品 大株紅景天注射液(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mL/支，國藥準(zhǔn)字Z330220021，批號：010873)。VEGF、胎肝激酶-1(FLK-1)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)(北京博奧生生物技術(shù)公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)。

1.3缺血預(yù)處理方法及大鼠心肌缺血模型制備 缺血預(yù)處理組大鼠在制備心肌缺血動物模型前3 d，尾靜脈注射大株紅景天注射液4 mL/(kg·d)，連續(xù)3 d，對照組及模型組注射等量生理鹽水。大鼠心肌缺血動物模型制備：在經(jīng)缺血預(yù)處理3 d后，參照文獻(xiàn)[5]，所有動物在造模前夜停止喂食，不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg )麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，接Ⅱ?qū)?lián)，采用BL-420F生物信號采集系統(tǒng)同步記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖。模型組及缺血預(yù)處理組經(jīng)尾靜脈注射垂體后葉素(1.5 IU/kg)，5 s內(nèi)注射完畢，觀察并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。當(dāng)出現(xiàn)明顯的ST段上移、T波高聳、竇性心動過緩、期前收縮等心律失常性心電圖即提示模型復(fù)制成功，之后缺血預(yù)處理組尾靜脈注射大株紅景天注射液4 mL/(kg·d)，連續(xù)7 d，對照組及模型組注射等量生理鹽水。

1.4檢測指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[6]，缺血預(yù)處理前3組大鼠各眼眶靜脈取血1 mL暫存至-30 ℃低溫冰箱保存待測，并在造模1h及治療7d后同上步驟分別眼眶靜脈取血各1mL，以3 000 r/h離心(離心半徑70 mm)取上清液，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清FLK-1及FLK-1 mRNA、HIF-1α及HIF-1α mRNA、VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠HIF-1α、HIF-1α mRNA表達(dá)情況 模型組在造模1 h及治療7d后HIF-1α、HIF-1α mRNA表達(dá)升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；缺血預(yù)處理組在造模1 h及治療7 d后HIF-1α、HIF-1α mRNA表達(dá)均明顯高于對照組、模型組及缺血預(yù)處理前(P均<0.05)，且治療7 d后二者表達(dá)明顯高于造模1 h(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠HIF-1α、HIF-1αmRNA表達(dá)情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與預(yù)處理前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與造模1h比較，P<0.05。

2.2各組大鼠VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況 模型組在造模1 h及治療7 d后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；缺血預(yù)處理組在造模1 h及治療7 d后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)明顯高于模型組與對照組及缺血預(yù)處理前(P均<0.05)，且治療7 d后二者表達(dá)明顯高于造模1 h(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠VEGF、VEGF mRNA表達(dá)情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與預(yù)處理前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與造模1 h比較，P<0.05。

2.3各組大鼠FLK-1、FLK-1 mRNA表達(dá)情況 模型組在造模1 h及治療7 d后FLK-1、FLK-1 mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P均<0.05)；缺血預(yù)處理組在造模1 h及治療7 d后FLK-1、 FLK-1 mRNA表達(dá)均明顯高于對照組、模型組及缺血預(yù)處理前(P<0.05)，且治療7 d后二者表達(dá)明顯高于造模1 h(P<0.05)。見表3。

3 討 論

近年來心肌缺血再灌注損傷的防治已取得了明確的成果, 大量中草藥被應(yīng)用到臨床防治缺血再灌注損傷，其中大株紅景天注射液在臨床上大量應(yīng)用并取得可靠療效。紅景天(Crassulaceae)為景天科植物紅景天或大花紅景天，主產(chǎn)于吉林、西藏、四川等高原高寒地區(qū)，素有“高原人參”之稱[7]。其性寒、味甘澀，歸脾、肺經(jīng)，藥用其根莖，大株紅景天注射液是紅景天經(jīng)現(xiàn)代加工提取的注射液?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，紅景天含紅景天甙元、紅景天甙、沒食子酸、二苯甲基六氫吡啶、β-谷甾醇等多種有效成分[8]，其中紅景天苷是其主要活性藥理成分[9]，具有抗缺氧、抗疲勞、抗微波輻射、抗寒冷作用[10]，可提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)心腦組織耐缺氧能力，抑制輻射引起的心和肝臟脂質(zhì)過氧化等。

表3 各組大鼠FLK-1、 FLK-1mRNA表達(dá)情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與預(yù)處理前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與造模1h比較，P<0.05。

機(jī)體正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動態(tài)平衡，血管內(nèi)皮及功能保持在正常狀態(tài)，當(dāng)心肌缺血時(shí)，機(jī)體會產(chǎn)生大量的氧自由基，心和肝臟等組織由于缺血再灌注產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，此時(shí)自由基清除酶活性降低，造成自由基清除酶對氧自由基清除能力下降，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，可促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及再生，參與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)[11]，故VEGF在臨床上常作為反映血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組FLK-1及FLK-1 mRNA、HIF-1α及HIF-1α mRNA、VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)均有不同程度增高，提示心肌缺血、缺氧是促進(jìn)VEGF分泌的最主要因素，血管內(nèi)皮受損嚴(yán)重。在應(yīng)用大株紅景天注射液后，缺血預(yù)處理組FLK-1及FLK-1 mRNA、HIF-1α及HIF-1α mRNA、VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)較模型組明顯增高，說明大株紅景天注射液具有促進(jìn)VEGF的分泌、誘導(dǎo)缺血心肌的血管再生、促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[12]。分析認(rèn)為，大株紅景天注射液具有活血化瘀、改善微循環(huán)、增加冠脈灌注和心肌供氧的作用，可能促進(jìn)Ca2+-ATP酶活性恢復(fù),增強(qiáng)Na+，K+-ATP酶活力,減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載,并通過Na+，K+ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換來抑制鈉鈣交換,阻止Ca2+內(nèi)流,改善心肌組織能量代謝[13]，進(jìn)而改善心肌缺血而起到保護(hù)作用有關(guān)[14]。劉毅等[15]報(bào)道紅景天可改善心肌組織的能量代謝，改善病灶缺血、水腫，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)，其對心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

缺血預(yù)處理在臨床防治缺血性疾病尤其缺血再灌注損傷中有重要意義，積極尋找具有促進(jìn)缺血心肌血管再生，減輕心肌缺血再灌注損傷，防止心肌細(xì)胞壞死的藥物意義重大。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大株紅景天注射液具有增加血管內(nèi)皮VEGF分泌的作用，但缺血再灌注損傷是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，大株紅景天注射液如何在缺血預(yù)處理各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮調(diào)節(jié)、干預(yù)和阻斷心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生，還有待于深入研究。

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Effect of Rhodiola rosea injection on VEGF in rats undergoing myocardial ischemic preconditioning

YANG Ping1, PENG Jixia2, CHEN Desen2, ZHU Kegang2

(1. Taihe Hospital of Shiyan (Affiliated Hospital of Hubei Medical University), Shiyan 442000, Hubei, China; 2. Hubei Medical Hospital, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to study the effect of Rhodiola rosea injection on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in rats undergoing acute myocardial ischemia preconditioning and its mechanism. Methods 24 rats were randomly divided into control group, model group, ischemic preconditioning group. Rat models of acute myocardial ischemia were established by tail vein injection of pituitrin in model group and ischemic preconditioning group. The expression of fetal liver kinase 1 (FLK-1), hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), VEGF protein and mRNA, were determined by double antibody sandwich EUSA method in every group before model establishing, 1h after establishing and 1 week after treatment. Results The expression of FLK-1 and FLK-1 mRNA, HIF-1α and HIF-1α mRNA, VEGF protein and mRNA increased significantly in ischemic preconditioning group in 1h after establishing and 1 week after treatment, and compared with that in control group, model group and before ischemic preconditioning, the differences were significant (P<0.05). Conclusion Rhodiola crenulate injection can stimulate the growth of neovascular endothelial cells, and relieve the vascular endothelial inflammation and injury degree in the rats with acute myocardial ischemia, so it has some protecting effect on rat myocardial ischemia reperfusion injury.

楊萍，女，主要從事臨床藥理學(xué)及皮膚激光美容的相關(guān)工作。

朱克剛,E-mail:cdscds1226@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.07.009

R-332

A

1008-8849(2015)07-0710-03

2014-09-30