薛春梅， 李男男， 趙永勛， 李環(huán)明， 邵德福， 李佳琳， 杜春梅， 李 麗， 董錫文

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江佳木斯 154007)

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紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

薛春梅， 李男男， 趙永勛， 李環(huán)明， 邵德福， 李佳琳， 杜春梅， 李 麗， 董錫文

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江佳木斯 154007)

摘要[目的] 選出適合紫丁香蘑(Lepista nuda) 菌絲生長的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。[方法] 以紫丁香蘑菌絲體干重和胞外糖含量為評價指標(biāo)，通過正交試驗篩選出最適合紫丁香蘑菌絲生長的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。[結(jié)果] 碳源對菌絲體生長的影響最大，其次是KH2PO4和氮源，最后是MgSO4。[結(jié)論] 最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉2%(w/V)，酵母浸粉0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH 7。

關(guān)鍵詞紫丁香蘑；菌絲；液體發(fā)酵

Selection of Culture Medium for Liquid Fermentation ofLepistaNudaMycelium

XUE Chun-mei, LI Nan-nan, ZHAO Yong-xun et al(College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

Abstract[Objective] The research aimed to select the culture medium for liquid fermentation most suitable for the growth ofLepistaNudamycelium. [Method] We tried to select the culture medium for liquid fermentation most suitable for the growth ofLepistaNudamycelium through orthogonal test, by measuring dry weight ofLepistaNudamycelium and extracellular sugar content. [Result] The effect of the mixture of carbon source and KH2PO4.on the growth of mycelium was less than carbon source, but greater than that of MgSO4. [Conclusion] The most suitable culture medium is as follows: soluble starch2%(w/V), yeast extract powder 0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH 7。

Key wordsLepistaNuda；Mycelium; Liquid fermentation

紫丁香蘑(Lepistanuda)屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomveomveotina)層菌綱(Hymenomyeetes)傘菌目(Agaricales)口蘑科(Trieholomataeeae)香蘑屬 (Lepista)，主要分布于中國、歐洲等地[1]。它是一種名貴的藥食皆用的野生真菌。紫丁香蘑野生真菌在黑龍江省分布范圍較廣[2]，但是數(shù)量稀少，更由于長期、大量的采摘，野生存留量已呈逐年遞減趨勢。因此，紫丁香蘑價格昂貴，是一種具有開發(fā)潛力的野生真菌。

紫丁香蘑具有較高的藥用價值和保健價值。其子實體含VB1、硬脂酸、神經(jīng)酞胺和麥角固醇類等化合物。紫丁香蘑還具有很高的藥用價值，對革蘭氏陽性菌、陰性菌，小鼠肉瘤和艾氏癌具有良好的抑制作用[3-4]。有研究表明，紫丁香蘑提取物對小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率分別為90%和100%[5]。紫丁香蘑提取物能調(diào)節(jié)機體正常的糖代謝，促進神經(jīng)傳導(dǎo)[6-7]。此外，還具有抗炎、抗補體、免疫和促進血小板凝聚以及抗流感病毒等作用[8-9]。紫丁香蘑從栽培到產(chǎn)菇采收需要很長的時間，且菇體生長的環(huán)境溫度較低，產(chǎn)量稀少，但它鮮嫩甜美，營養(yǎng)價值高，含有18種氨基酸，含鈣、鐵、磷、粗蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等多種營養(yǎng)物質(zhì)。在歐洲，它的受歡迎程度與松茸、牛肝菌齊名，在法國被視為上等食材[10]。

目前，國內(nèi)對紫丁香蘑液體發(fā)酵技術(shù)的研究較少。筆者以紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵所需的碳源、氮源、無機鹽為研究對象，篩選出最適合其生長的液體培養(yǎng)基。

1材料與方法

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基。

(1)斜面培養(yǎng)基。馬鈴薯20%(w/V)，蔗糖2%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，瓊脂2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，VB10.001%(w/V)，pH自然。

(2)種子培養(yǎng)基。馬鈴薯20%(w/V)，蔗糖2%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，VB10.001%(w/V)，pH自然。

(3)液體培養(yǎng)基。馬鈴薯20%(w/V)，碳源2%(w/V)，氮源0.5%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH自然。

1.2.2菌絲體分離。菌種分離采用組織分離法。選取生長健壯、菌柄粗壯、菌蓋無病蟲害的子實體。用濃度75%酒精棉球?qū)ψ訉嶓w進行常規(guī)表面消毒后，用滅菌的小刀將其菌蓋縱向切開，再用滅菌的手術(shù)刀將表皮與菌褶之間沒暴露的組織切成小拇指指甲大小的一小塊，將其接種在斜面培養(yǎng)基上，之后在25 ℃下培養(yǎng)，待其長滿試管。

1.2.3菌種保存。將紫丁香蘑菌種置于4 ℃冰箱中保存，并且每1~3月用新鮮的培養(yǎng)基活化一次。菌種使用前先用新鮮培養(yǎng)基活化培養(yǎng)。

1.2.4培養(yǎng)方法。

在生物教學(xué)中，教學(xué)是以認(rèn)知學(xué)習(xí)理論為基礎(chǔ)的，是學(xué)生主動建構(gòu)知識意義的過程，是以學(xué)生的學(xué)為中心的。這種以學(xué)生為中心，強調(diào)學(xué)生主動進行知識構(gòu)建的教學(xué)設(shè)計，符合人本主義及素質(zhì)教育的要求。作為教師，首先必須從思想上實現(xiàn)自身角色和行為的轉(zhuǎn)變。在教學(xué)中，教師的教學(xué)行為轉(zhuǎn)變主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

(1)菌種活化。將保存的菌種在28 ℃下培養(yǎng)1 d，在無菌條件下截取一小塊約0.5 cm2，接種于試管中，于25 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿管后備用。

(2)種子培養(yǎng)。在250 ml三角瓶中裝入100 ml種子培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，在無菌條件下接種4塊約0.5 cm2于液體培養(yǎng)基中，然后在25 ℃、110 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)13 d。

(3)搖瓶培養(yǎng)。將種子液接入到液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，于25 ℃、110 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)13 d。

1.2.5培養(yǎng)基的篩選試驗。

(1)碳源的篩選試驗。 以液體培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖等5個碳源處理，另設(shè)不加碳源為對照。每250 ml三角瓶裝100 ml培養(yǎng)基，接種量5%，于25 ℃、110 r/min培養(yǎng)13 d。試驗重復(fù)3次。以菌絲體干重和胞外糖含量為評價指標(biāo)，篩選出最佳碳源。

(2)氮源的篩選試驗。 以液體培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置硝酸鉀、硫酸銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5個氮源處理，另設(shè)不加氮源為對照。每250 ml三角瓶裝100 ml培養(yǎng)基，接種量5%，于25 ℃、110 r/min培養(yǎng)13 d。試驗重復(fù)3次。以菌絲體干重和胞外糖含量為評價指標(biāo)，篩選出最佳氮源。

(3)營養(yǎng)因素正交試驗。以菌絲體干重為評價指標(biāo)，根據(jù)單因素篩選試驗結(jié)果，對最佳碳源、氮源、無機鹽進行正交試驗(表1)，以便篩選出最佳組合。

(4)初始pH篩選試驗。以正交試驗篩選出來的最佳組合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每250 ml三角瓶裝100 ml培養(yǎng)基，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10共8個梯度。每個梯度重復(fù)3次。接種量5%，于25 ℃、110 r/min條件下培養(yǎng)13 d。以菌絲體干重和胞外糖含量為評價指標(biāo)，篩選出最適初始pH。

表1　L9(34)正交試驗設(shè)計　%

1.2.6液體發(fā)酵液中菌絲體的收集。將發(fā)酵后的菌絲體置于離心機中，4 000 r/min離心10 min，收集菌絲體沉淀，菌絲體用蒸餾水洗滌，重復(fù)3次，再用濾紙吸至不滴水。將所得菌絲體于55 ℃烘干至恒重，稱重。

1.2.7胞外糖收集。將“1.2.6”中離心得到的濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，在80 ℃下逐漸濃縮至小體積，濃縮后的濾液以1∶2的比例加入濃度95%乙醇溶液，放入4 ℃冰箱中醇沉過夜，4 000 r/min離心10 min，沉淀物用無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌，得到胞外糖。干燥后，用電子天平稱重。

2結(jié)果與分析

2.1不同碳源對紫丁香蘑菌絲體生長的影響由圖1可知，在這些碳源中，以可溶性淀粉為培養(yǎng)基中的碳源，紫丁香蘑菌絲體干重和胞外糖含量相比于其他都較高，分別為3.951和4.653 g/L；菌球較大，且大小均勻，密度較高。所以，確定可溶性淀粉為紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳源。

2.2不同氮源對紫丁香蘑菌絲體生長的影響由圖2可知，在這些氮源中，有機氮源比無機氮源更有利于紫丁香蘑菌絲體的生長，其中以酵母浸粉為培養(yǎng)基中的氮源，菌絲體干重和胞外糖含量相比于其他都較高，分別為3.171和2.905 g/L，菌球較大，且大小均勻，密度較高，所以確定可溶性淀粉為紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適氮源。

2.3不同營養(yǎng)因素正交試驗由表2和表3可知，紫丁香蘑液體發(fā)酵所獲得的最優(yōu)組合為A2B2C3D1，此時獲得的菌絲體干重為4.213 g/L，即優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基為可溶性淀

表2　不同營養(yǎng)因素正交試驗

粉2%(w/V)，酵母浸粉0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%。由極差R值可知，影響紫丁香蘑菌絲產(chǎn)量的4個因素主次順序為A>C>B>D。由方差分析可知，可溶性淀粉、酵母浸粉、KH2PO4和MgSO44個因素都達0.05顯著水平。

2.4不同pH對紫丁香蘑菌絲體生長的影響由圖3可知，紫丁香蘑菌絲體在偏酸、偏堿條件下幾乎不生長，而在中性條件下菌絲體生長旺盛，菌絲體干重和胞外糖含量分別為4.333和4.957 g/L，所以確定紫丁香蘑菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH為7。

表3　不同營養(yǎng)因素正交試驗方差分析

3討論

對紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選有利于菌絲體在液體發(fā)酵中的正常生長代謝，提高其產(chǎn)量，為后續(xù)的紫丁香蘑菌絲體的研究與開發(fā)提供資源保障。通過碳源、氮源、pH單因素試驗，發(fā)現(xiàn)最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為酵母浸粉，最佳pH為7。這與彭衛(wèi)紅等[11]報道的碳源和氮源對紫丁香蘑菌絲生長的影響研究結(jié)論相符。試驗表明，有機氮比無機氮更利于其菌絲體的生長。這是因為有機氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸之外,往往還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長素等物質(zhì),更有利于菌體的吸收。pH過低或過高可能致使培養(yǎng)基中某些重要的營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解,不利于菌絲體對這些物質(zhì)的吸收和利用。pH的變化也會改變菌絲體各種酶的活性,影響細(xì)胞膜功能,使得細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的形成。正交試驗結(jié)果表明，碳源對菌絲體生長的影響最大，其次是KH2PO4和氮源，最后是MgSO4；紫丁香蘑菌絲體生長的最適培養(yǎng)基為可溶性淀粉2%(W/V)，酵母浸粉0.5%(W/V)，KH2PO40.3%(W/V)，MgSO40.05%。 該試驗只對紫丁香蘑菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行了初步的篩選，對培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、接種量等有待進一步的研究。

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收稿日期2015-10-19

作者簡介薛春梅(1975- )，女，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事應(yīng)用微生物學(xué)方面的研究。

基金項目黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12531696)。

中圖分類號S 646

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2015)33-011-02