子建文，資云海，唐 輝，李 倩，張勝梅，李曉霞

高原地區(qū)土壤微生物分布已有報(bào)道，但云南高海拔地區(qū)土壤微生物調(diào)查報(bào)道較少，本研究對(duì)香格里拉地區(qū)遠(yuǎn)離農(nóng)戶、人群、農(nóng)牧場(chǎng)的山脈土壤微生物的分布和藥敏情況進(jìn)行了調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇 2014 年11 月中旬于香格里拉，樣地均為由稀疏灌木叢覆蓋的山坡地，且遠(yuǎn)離農(nóng)戶、人群、牧場(chǎng)10 km 以上，在香格里拉縣城的東南西北方向20 km 以外分別設(shè)置具有代表性的1、2、3 和4 號(hào)采樣點(diǎn)，經(jīng)緯度分別是99°10′27″E27°29′18″N、99°24′31″E27°36′25″N、99°31′16″E27°32′9″N 和99°42′4″E27°49′2″N，海拔分別為3312、3185、3489 和3289 m，每個(gè)點(diǎn)分為陽(yáng)坡和陰坡。

1.2 標(biāo)本采集 按隨機(jī)布點(diǎn)法[1]，在每個(gè)采樣點(diǎn)的陽(yáng)坡和其對(duì)應(yīng)的陰坡分別以“Z”字型選取4 個(gè)點(diǎn)，除去地面植被和枯枝落葉，鏟除1 cm 左右的表土，挖好剖面后，燒灼法消毒取樣鏟，取深度為30 cm 的黃土，需氧標(biāo)本放于無(wú)菌均質(zhì)袋中，厭氧標(biāo)本放入無(wú)菌厭氧袋內(nèi)，標(biāo)記后密封運(yùn)送。 無(wú)菌均質(zhì)袋由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 需氧菌與真菌 稱(chēng)取10 g 新鮮土壤，加入盛100 ml無(wú)菌水的500 ml 三角瓶?jī)?nèi)，振蕩10 min，使土壤均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，吸取1 ml 土懸液到9 ml 無(wú)菌水中，按10 倍法依次稀釋?zhuān)婢♂?05倍，細(xì)菌稀釋106倍。 取稀釋好的菌液傾注3 塊血平板(1 ml/塊)，置于37 ℃溫箱孵育48 h；真菌傾注3 塊沙氏培養(yǎng)基(1 ml/塊)，置于25 ℃溫箱孵育72 h，然后計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算出土壤中微生物數(shù)量。 觀察平板上的菌落形態(tài)、顏色。 對(duì)生長(zhǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD 全自動(dòng)微生物鑒定儀（賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。 真菌鑒定根據(jù)肉眼觀察在沙氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)及顯微鏡觀察真菌孢子形態(tài)。將性狀相同的菌類(lèi)進(jìn)行歸類(lèi)。藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）推薦的K-B 法，藥敏紙片由貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供。

1.3.2 厭氧菌 將標(biāo)本接種于9.0 cm 直徑的厭氧培養(yǎng)基中，置于35 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 系統(tǒng)及其配套的測(cè)試卡進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC-25922、 銅綠假單胞菌ATCC-27853、金黃色葡萄球菌ATCC-25923，購(gòu)自云南省臨床檢驗(yàn)中心。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件包分析數(shù)據(jù)，WHonet 5 軟件包對(duì)藥敏資料進(jìn)行分析。 不同采樣點(diǎn)的陰坡或陽(yáng)坡微生物數(shù)量之間比較用方差分析，同一采樣點(diǎn)的陽(yáng)坡和陰坡之間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各采樣點(diǎn)微生物分布 4 個(gè)采樣點(diǎn)陽(yáng)坡的細(xì)菌總數(shù)和真菌總數(shù)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），陰坡之間的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但4 個(gè)采樣點(diǎn)的陽(yáng)坡與陰坡的微生物總數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05），即細(xì)菌（或真菌）總數(shù)陰坡＞陽(yáng)坡（見(jiàn)圖1、2）。

2.2 各采樣點(diǎn)微生物構(gòu)成 各種細(xì)菌或真菌在不同采樣點(diǎn)的構(gòu)成比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）；各采樣點(diǎn)的厭氧菌構(gòu)成比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05），但革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌及真菌構(gòu)成比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05），革蘭陰性菌＞革蘭陽(yáng)性菌＞厭氧菌＞真菌（表1）。

圖1 各采樣點(diǎn)陰陽(yáng)面土壤中細(xì)菌數(shù)均值

圖2 各采樣點(diǎn)陰陽(yáng)面土壤中真菌數(shù)均值

表1 香格里拉不同采樣點(diǎn)土壤中微生物構(gòu)成[株(%)]

表2 香格里拉土壤中革蘭陰性菌對(duì)常用抗生素藥物的敏感率[株（%）]

表3 香格里拉土壤中革蘭陽(yáng)性菌對(duì)常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表4 香格里拉土壤中厭氧菌對(duì)常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表5 香格里拉土壤中真菌對(duì)藥物的敏感率[株(%)]

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗(yàn) 氨基糖苷類(lèi)和半合成青霉素類(lèi)抗生素敏感率較高，除嗜水氣單孢菌對(duì)阿米卡星敏感率為85.7%外，其余均為100.0%；喹諾酮類(lèi)中，左氧氟沙星對(duì)所鑒定的細(xì)菌全敏感， 其余細(xì)菌敏感性在75.3%～100.0%之間。頭孢菌素中，革蘭陰性菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦敏感率100.0%；其次是頭孢噻吩和頭孢唑啉，敏感率大于85.7%； 除銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌敏感率介于76.5%～82.9%外，其余細(xì)菌對(duì)頭孢曲松和頭孢呋辛鈉敏感率均為100.0%； 而銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌對(duì)頭孢西丁敏感率100.0%， 其余細(xì)菌敏感率介于52.4%～56.5%之間。 革蘭陰性菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)敏感率51.8%～100.0%。 棲稻黃色單胞菌和嗜水氣單孢菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感率100.0%，其余細(xì)菌敏感率介于75.9%～96%之間。嗜水氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和河流弧菌對(duì)氨曲南敏感性100.0%，其余細(xì)菌介于50.6%～57.3%之間。 見(jiàn)表2。

2.4 革蘭陽(yáng)性菌藥敏試驗(yàn) 所分離得到的革蘭陽(yáng)性菌對(duì)青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、妥布霉素、阿米卡星和萬(wàn)古霉素普遍敏感，敏感率在97.4%以上；腐生葡萄球菌對(duì)所有抗生素敏感，未發(fā)現(xiàn)耐藥株。 見(jiàn)表3。

2.5 厭氧菌藥敏試驗(yàn) 分離出的4 種厭氧菌對(duì)常用抗生素的敏感率在90.9%以上。 除壞名梭菌對(duì)氯霉素和青霉素敏感率為90.9%外，其余敏感率均為100.0%。 見(jiàn)表4。

2.6 真菌藥敏試驗(yàn) 合成類(lèi)抗生素、伏立康唑及伊曲康唑?qū)? 種真菌全覆蓋， 敏感率均為100.0%。 真菌對(duì)克霉唑、特比萘芬的敏感率在90.0%以上。 見(jiàn)表5。

3 討論

高海拔地區(qū)具有獨(dú)特的自然地理環(huán)境，其主要特征是高寒、缺氧、日照時(shí)間長(zhǎng)，輻射強(qiáng)，降水較少，相對(duì)干燥[2]。該區(qū)域山脈陰陽(yáng)坡面在日照輻射、相對(duì)溫濕度等方面差異顯著，造成區(qū)域內(nèi)微生物數(shù)量分布差異[3-5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，香格里拉高海拔山脈陰坡面土壤中微生物數(shù)量大于陽(yáng)坡。香格里拉高海拔山坡地域因其獨(dú)特的高原自然地理環(huán)境和人文環(huán)境，土壤污染小，土壤微生物數(shù)量明顯低于其他低海拔地區(qū)。

該區(qū)域4 個(gè)采樣點(diǎn)土壤微生物數(shù)量及構(gòu)成比之間無(wú)顯著差異， 各點(diǎn)土壤中微生物以細(xì)菌為主， 平均占96.54%，真菌數(shù)量較少，平均占3.46%。細(xì)菌中革蘭陰性菌數(shù)量多于革蘭陽(yáng)性菌；革蘭陰性菌中優(yōu)勢(shì)菌為痢疾志賀菌（8.54%）、 棲稻黃色單胞菌 （8.16%）、 銅綠假單胞菌（7.87%）和侵肺巴斯德菌（7.97%），革蘭陽(yáng)性菌中優(yōu)勢(shì)菌為腐生葡萄球菌（14.59%）、蠟樣芽胞桿菌（14.59%）和蘇云金芽孢桿菌（8.54%）。

該區(qū)域土壤中微生物藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，香格里拉高海拔山脈坡面土壤中細(xì)菌、 真菌對(duì)絕大多數(shù)抗生素敏感，高海拔山地環(huán)境中土壤微生物對(duì)常用抗生素的敏感性較低海拔地區(qū)高，其中厭氧菌僅檢出1 株耐氯霉素的壞名梭菌，其余菌株敏感率均為100%；但是也檢出對(duì)頭孢菌素、氨曲南及紅霉素等耐藥的菌株，說(shuō)明長(zhǎng)期廣泛使用此類(lèi)抗生素，即使在遠(yuǎn)離農(nóng)戶、人群、牧場(chǎng)的高海拔區(qū)域，也已有耐藥菌株的存在。

高海拔地區(qū)自然災(zāi)害和事故也時(shí)有發(fā)生，人員受傷不可避免，尤其是火器傷傷口創(chuàng)面可不同程度被空氣和土壤中的細(xì)菌污染，創(chuàng)面感染細(xì)菌的種類(lèi)與受傷部位周邊存在的菌群有密切關(guān)系[6]，且感染以條件致病菌和耐藥菌株為多[7]。相關(guān)動(dòng)物模型試驗(yàn)表明，傷口早期感染細(xì)菌與所處環(huán)境細(xì)菌譜有交叉重疊[8]。 摸清此類(lèi)地域土壤微生物本底狀況，為創(chuàng)傷感染細(xì)菌檢測(cè)和治療提供依據(jù)具有現(xiàn)實(shí)意義。

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