李偉豐

（河南濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源 459000）

基于近紅外熒光技術(shù)快速診斷豬瘟病毒

李偉豐

（河南濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源 459000）

通過對(duì)比豬瘟病毒（CSFV）經(jīng)典株（shimen）和豬瘟弱毒疫苗株（HCLV）的基因組信息，設(shè)計(jì)特異的引物和探針，通過擴(kuò)增獲得的核酸產(chǎn)物用于在固定有特異探針的微孔板中進(jìn)行雜交。雜交結(jié)果使用近紅外熒光進(jìn)行掃描檢測(cè)。利用近紅外熒光可以獲得高信噪比的檢測(cè)結(jié)果，使用微孔板可以方便地進(jìn)行多樣品同時(shí)操作。

豬瘟野毒感染近紅外熒光診斷高通量

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬的一種以高熱稽留、梗死、出血、壞死和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。目前，該病主要在亞洲、歐洲、非洲、美洲的國家與地區(qū)流行。在我國，當(dāng)前各省市均有豬瘟的流行，每年因豬瘟死亡的約占病死豬的l/3以上。我國每年由豬瘟導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失有數(shù)10億元，造成了巨大的資源浪費(fèi)。

基于我國目前的國情，效仿美歐所采取的撲殺措施在經(jīng)濟(jì)上是很難承受的，所以，開發(fā)一種能夠快速檢測(cè)豬瘟感染的方法是很有必要的。目前，CSFV診斷的主要方法包括：病原學(xué)診斷、血清學(xué)檢測(cè)、間接血凝試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法，其中，分子生物學(xué)方法因?yàn)榫哂懈叨忍禺愋院挽`敏性而受到越來越多的關(guān)注。分子生物學(xué)診斷的原理主要依靠設(shè)計(jì)特異的引物，使用PCR或qPCR等方法進(jìn)行鑒別。

利用熒光技術(shù)檢測(cè)生物大分子在生化分析和研究中應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛。一般的熒光染料激發(fā)和檢測(cè)波長分子位于可見光范圍（約400～700 nm）內(nèi)，機(jī)體的內(nèi)源性物質(zhì)、雜質(zhì)等經(jīng)可見光激發(fā)都有很強(qiáng)的自體熒光，易產(chǎn)生高背景熒光干擾檢測(cè)，所以一般的熒光染料不能直接用于生物檢測(cè)。近紅外光（Near-Infrared，NIR）波長范圍在700～900 nm，在這個(gè)范圍內(nèi)生物體和生物組織自身吸收散射和自發(fā)熒光背景都比較低，檢測(cè)的信噪比和靈敏度相比可見光譜熒光都有極大的提高。

本文中我們介紹一種利用近紅外熒光（NIRF）快速診斷CSF的方法，首先使用常規(guī)方法處理病料，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，使用引物進(jìn)行反向延伸，同時(shí)，引入biotin修飾的dUTP，獲得的延伸產(chǎn)物與微孔板中固定的探針進(jìn)行雜交，然后使用修飾有近紅外熒光染料的鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)方法具有高通量、特異性高，快速等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可以排除豬瘟弱毒疫苗的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

TRIzol試劑購自Invitrogen公司；Taq聚合酶、RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker等購自大連寶生物工程有限公司；GoldView購于天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶MLV購于Promega公司，DEPC購于Ameresco公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品；近紅外熒光染料購自美國LI-COR公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

DNA-BINDTMWhite 96 Well Polystyrene Microplate（Corning，2505），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司），高速冷凍離心機(jī)3-30KS（sigma公司），凝膠成像儀（Bio-Rad），恒溫金屬?。╡pendof）。

1.1.2 病料

豬瘟兔化弱毒疫苗有**提供，收集濟(jì)源市周邊不同地區(qū)的疑似豬瘟病例10個(gè)，送檢病料取脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體。

1.1.3 探針和引物設(shè)計(jì)

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

在無菌環(huán)境中剪去脂肪，肌腱等組織。按照1∶5的比例加入無菌PBS，使用研磨器研磨后放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。按照說明書使用TRIzol試劑提取備檢病料和豬瘟兔化弱毒疫苗的RNA，溶解后測(cè)定濃度，取3μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系共計(jì)20μl：5xRT buffer 4μl；dNTP（10mmol/μl）2μl；RNAase抑制劑 1μl；Rev-R引物（10pmol/μl）1μl；反轉(zhuǎn)錄酶（200U/ μl）1μl；DEPC水 6μl；混合后42℃水浴40min，然后95℃維持5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系50μl，其中包括5μl的cDNA產(chǎn)物，其中，按照5000：1加入biotin-dUTP，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 探針設(shè)計(jì)及固定

根據(jù)NCBI網(wǎng)站收錄的豬瘟病毒基因組信息，經(jīng)典株（CSFV）登錄號(hào)：12657941，兔弱化株（HCLV）登錄號(hào)：AF531433.1，通過序列比對(duì)設(shè)計(jì)探針和引物。

將合成的5'端NH2修飾的探針粉末溶于寡核苷酸結(jié)合緩沖液（OBB，50mM磷酸鈉，pH8.5；1mM EDTA，pH 8.0；50mmol磷酸鈉配制：1mol Na2HPO4：1M NaH2PO4=43.65：1；），制成100μM的貯存液，使用OBB稀釋至0.25 pmol/μl后，以每孔100μl加入微孔板，4℃孵育過夜；使用OBB溶液反復(fù)清洗5遍后，以200μl/well加入封閉液（3% BSA），37℃孵育30min。

1.2.3 探針固定效果檢測(cè)

稀釋H-Con和C-Con至濃度為2nm，分別加入固定好探針的孔中，每孔60μl，然后300RPM，50℃混勻，維持1h后，使用馬來酸（0.1mol馬來酸，0.15molNaCl，pH 7.0）清洗3次；加入提前稀釋好的Streptavidin-IRDye800CW（1∶10000），每孔加入80μl后，37℃，1h；使用馬來酸清洗3次以上，將微孔板放入Odyssey近紅外激光成像系統(tǒng)掃描檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 病料檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段后，測(cè)定濃度。稀釋為2 nm后，95℃，5 min變性后迅速加入固定有探針的微孔板中，每孔加入60μl，剩余步驟按照前述操作進(jìn)行。

其中Fix-C用于確定豬瘟病毒是否存在，F(xiàn)ix-H用于當(dāng)Fix-C為陽性時(shí)區(qū)分是野毒感染還是疫苗接種。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)結(jié)果

根據(jù)NCBI收錄的豬瘟病毒與兔化弱毒株基因組信息，進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在3’端有一個(gè)9bP的插入突變，[12]利用這個(gè)差異設(shè)計(jì)探針用于區(qū)分野毒感染和疫苗接種。比對(duì)結(jié)果見圖1。

圖1 CSFV和HCLV基因組序列比對(duì)結(jié)果（局部）

2.2 PCR結(jié)果

使用1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)PCR的結(jié)果，結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出設(shè)計(jì)的引物都可以從CSFV和HCLV中擴(kuò)增出片段，而產(chǎn)物中9個(gè)堿基的差異通過凝膠檢測(cè)是不能發(fā)現(xiàn)差別的。

圖2 對(duì)病料樣品和疫苗樣品擴(kuò)增結(jié)果（H：HCLV，C：CSFV，1-10：10個(gè)待檢測(cè)病料，N：NC，M是DNA Marker。）

2.3 探針固定結(jié)果

將合成的探針利用其上修飾的氨基基團(tuán)與微孔板上的NOS基團(tuán)共價(jià)連接后固定到微孔板，將互補(bǔ)探針加入微孔板進(jìn)行雜交，每個(gè)探針重復(fù)2次。

圖3 探針在微孔板固定后的檢測(cè)（第1列：Fix-C，第2列：Fix-H，第3列：空白對(duì)照）

2.4 雜交檢測(cè)結(jié)果

用HCLV和CSFV的PCR結(jié)果作為樣品用于雜交檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示。從結(jié)果可以看出所設(shè)計(jì)的探針可以區(qū)分HCLV和CSFV。

圖4 HCLV和CSFV擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)（A、B：Fix-C，C、D：Fix-H，1：CSFV，2：HCLV）

對(duì)PCR呈陽性的結(jié)果進(jìn)行探針檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出9個(gè)陽性病例均為野毒感染。

圖5 送檢病料的檢測(cè)結(jié)果（A、B：Fix-C，C、D：Fix-H，1、3-10：陽性樣品）

3 分析與討論

目前豬瘟試驗(yàn)室診斷方法在敏感性、特異性、時(shí)效性等方面都存在各自的不足，而且這些方法都不能有效地區(qū)分野毒感染與疫苗接種。按照國際通行的做法[1，13]，一旦暴發(fā)豬瘟疫情，對(duì)涉及的所有豬只一律進(jìn)行撲殺焚燒處理。依照我國現(xiàn)有國情[14]，這將會(huì)導(dǎo)致大量的非野毒感染豬被“錯(cuò)殺”，損害養(yǎng)豬者利益，阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，破壞肉品的穩(wěn)定供應(yīng)。

本研究利用豬瘟病毒的經(jīng)典株和兔化弱毒株在基因組序列上的差異，這些差異可以利用不同的探針進(jìn)行檢測(cè)，以區(qū)分確診病例是野毒感染還是疫苗接種。利用微孔板操作可以實(shí)現(xiàn)快速、批量的操作，檢測(cè)通量高。本文中的10個(gè)病料樣品使用一個(gè)微孔板即可完成檢測(cè)。

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