韋秀梅 楊頂瓏 王 圣 姜 緒 劉相全 楊建敏 房景輝

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071)

海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)是在一定因子的誘導下完成的。已有研究表明, 金屬離子(K+、Ca2+、Rb+和 Cs+)、左旋多巴(L-DOPA)、GABA、5-羥色胺(5-HT)、膽堿及其衍生物、脂肪酸類和兒茶酚胺等對海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)均有一定的誘導作用(Couper et al, 1996; Yamamoto et al, 1996; 劉春林等, 2003; Zhao et al, 2003; Yu et al, 2007; Matsuura et al, 2009)。其中, K+的誘導效果明顯并且應用范圍較廣, 受到研究者的普遍關注。

氯化鉀(KCl)溶液中的 K+通過影響細胞膜電位,使細胞膜去極化, 誘導海洋無脊椎動物幼蟲變態(tài)(Baloun et al, 1984; Yool et al, 1986)。KCl可以誘導多種軟體動物幼蟲附著變態(tài)(Baloun et al, 1984; Eyster et al, 1988; Yool et al, 1986; Yang et al, 1995; 柯才煥等, 1998; Bryan et al, 1998; 張濤等, 2003), 也可以誘導棘皮動物幼蟲附著變態(tài)(王波等, 2002; 劉春林等,2008)。在 K+誘導海膽幼蟲附著變態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn),用 K+濃度為 30—100 mmol/L的海水浸泡紫海膽(Anthocidaris crassispina)的后期八腕幼蟲10—60 min,24 h后其變態(tài)率在90%以上; 50mmol/L的KCl誘導蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotus intermedius)幼體5—10h, 可提高其變態(tài)率并降低死亡率(王波等, 2002;劉春林等, 2008)。另外, K+對馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)和光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)等棘皮動物的幼蟲均有誘導變態(tài)效果(王波等, 2002;劉春林等, 2008), 但尚未見其誘導仿刺參(Apostichopus japonicus)幼蟲附著變態(tài)的研究。

與其它棘皮動物類似, 附著變態(tài)期是仿刺參幼蟲向成體轉變過程中一個必不可少的關鍵時期。仿刺參幼蟲在附著變態(tài)期對外界環(huán)境因子的變化比較敏感, 最易發(fā)生大批量死亡。因此, 幼蟲附著變態(tài)率的高低決定著仿刺參育苗的成敗, 如何提高幼蟲的附著變態(tài)率、縮短附著變態(tài)時間成為仿刺參苗種生產中亟待解決的問題。本研究探討KCl對仿刺參幼蟲附著變態(tài)的誘導作用, 比較不同濃度KCl溶液以及處理時間對仿刺參幼蟲附著變態(tài)和發(fā)育的影響, 旨在為提高仿刺參苗種生產的技術水平提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 幼蟲來源與培養(yǎng)條件

仿刺參(Apostichopus japonicus)樽形幼蟲由山東蓬萊海益水產有限公司提供。培養(yǎng)期間海水溫度為18—19°C、鹽度為31—32。實驗分兩組: 燒杯組和六孔板組, 其中燒杯組的幼蟲培養(yǎng)密度為 0.1個/mL,投喂人工餌料(紅酵母、螺旋藻、海泥和干酵母); 六孔板組的幼蟲培養(yǎng)密度為1個/mL, 投喂新月菱形藻。

1.2 實驗操作與管理

實驗海水經 0.22μm 濾膜過濾, 實驗處理根據KCl(國藥集團化學試劑有限公司)濃度高低分為低濃度組(10、30和 50 mmol/L)和高濃度組(100、300和500 mmol/L)。實驗分為兩部分, 燒杯組實驗目的是分析 KCl對仿刺參幼苗附著變態(tài)的影響; 六孔板組實驗目的是觀察誘導后各時間點仿刺參幼蟲變態(tài)發(fā)育情況, 統(tǒng)計各期幼蟲數(shù)量, 分析KCl對仿刺參幼苗發(fā)育的影響。

燒杯組實驗: 將1 L不同濃度的KCl溶液注入2 L燒杯中, 每個燒杯放置100個仿刺參樽形幼蟲進行誘導。低濃度組分別誘導6、12和24 h, 高濃度組分別誘導10和30 min。以未添加KCl的過濾海水處理組為對照, 每個處理設置三個平行。誘導結束后, 將實驗組幼蟲用200目篩絹濾出, 并在過濾海水中繼續(xù)培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)過程中使用經200目篩絹過濾的人工餌料投喂。培養(yǎng)結束時, 計算燒杯內幼蟲取食餌料留下的斑點, 計作附著幼蟲數(shù)量。

六孔板組實驗: 取10 mL不同濃度的KCl溶液于六孔板中, 每孔放置約 10個仿刺參樽形幼蟲進行誘導。低濃度組分別誘導6、12和24 h; 高濃度組分別誘導10和30 min, 以未添加KCl的過濾海水處理組為對照, 每個處理設置三個平行。誘導結束后, 將實驗組仿刺參幼蟲用200目篩絹濾出, 并在過濾海水中繼續(xù)培養(yǎng), 培養(yǎng)餌料為新月菱形藻, 分別在12、24、36、48、60、72、96和120 h時于顯微鏡下觀察仿刺參發(fā)育情況并統(tǒng)計樽形幼蟲、五觸手早期幼蟲、五觸手晚期幼蟲、稚參和死亡個體數(shù), 分析在不同濃度KCl作用下仿刺參幼蟲變態(tài)發(fā)育情況。

1.3 數(shù)據計算與處理

數(shù)據的統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和 T檢驗, 使用 Duncan法進行多重比較, 以P＜0.05為差異顯著水平。

2 實驗結果

2.1 KCl對仿刺參幼蟲附著變態(tài)的誘導

燒杯組實驗結果顯示: 在低濃度 KCl誘導實驗組中, 對照組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率為 38.33%, 處理組幼蟲的附著變態(tài)率為 53.67%—71.00%, 比對照組提高15.34%—32.67%。在相同KCl濃度條件下, 不同處理時間組之間的顯著差異性見圖 1a。實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率均顯著高于對照組(P＜0.05); 在10mmol/L處理濃度下, 隨處理時間增加, 實驗組幼蟲附著變態(tài)率顯著提高(P＜0.05); 在 30mmol/L處理濃度下, 24h處理組顯著高于其它兩實驗組(P＜0.05);而在 50mmol/L處理濃度下, 各實驗組間差異不顯著(P＞0.05)。另外, 相同處理時間條件下, KCl濃度對幼蟲附著變態(tài)率影響顯著(P＜0.05)。如6 h處理條件下, 30 mmol/L組的幼蟲附著變態(tài)率顯著高于10和50 mmol/L組(P＜0.05); 24 h處理條件下, KCl濃度為10和 30 mmol/L時的幼蟲附著變態(tài)率均顯著高于50 mmol/L時的幼蟲附著變態(tài)率(P＜0.05)。在本實驗中, 30 mmol/L (24 h)實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率最高, 為71.00%; 50 mmol/L (12 h)實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率最低, 為53.67%。

在高濃度 KCl誘導實驗組中, 仿刺參幼蟲附著變態(tài)率為 54.00%—69.00%, 相對于對照組 38.33%,附著變態(tài)率提高15.67%—30.67%。在相同KCl濃度條件下, 不同處理時間組之間的顯著差異性見圖1b。實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率均顯著高于對照組(P＜0.05); 100mmol/L和 300mmol/L處理濃度下, 不同處理時間對幼蟲附著變態(tài)率的影響不顯著(P＞0.05);而在500mmol/L處理濃度下, 30min組顯著高于10min組(P＜0.05)。另外, 10 min實驗組, 300 mmol/L處理的幼蟲附著變態(tài)率顯著高于其它兩處理(P＜0.05); 而在30 min組內則無顯著差異(P＞0.05)。在本實驗中, 300 mmol/L(10 min)實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率最高, 為69.00%; 而500 mmol/L (10 min)實驗組最低, 附著變態(tài)率僅為54.00%。

圖1 不同濃度KCl溶液處理不同時間后仿刺參幼蟲的附著變態(tài)率Fig.1 Metamorphosis rates of A. japonicus larva treated with KCl in different concentrations and durations

2.2 KCl對仿刺參幼蟲發(fā)育變態(tài)的影響

在六孔板實驗中, 對照組于24 h出現(xiàn)早期五觸手幼蟲, 在 120 h早期五觸手幼蟲占幼蟲總數(shù)的18.52%, 晚期五觸手幼蟲占22.22%, 稚參占14.81%,幼蟲死亡率為 7.41% (圖 2a); 低濃度實驗組中除30 mmol/L (12 h)實驗組外, 其它實驗組于12 h出現(xiàn)早期五觸手幼蟲, 出現(xiàn)時間均早于對照組。各實驗組其它階段幼蟲出現(xiàn)的時間也有差異, 如 10 mmol/L(6 h)實驗組, 晚期五觸手幼蟲出現(xiàn)于36 h, 稚參出現(xiàn)于60 h, 120 h稚參比例為33.33% (圖2b); 而10 mmol/L(12 h)實驗組于48 h出現(xiàn)晚期五觸手幼蟲, 72 h出現(xiàn)稚參, 120 h稚參比例為54.97% (圖2c); 而30 mmol/L(12 h)實驗組晚期五觸手幼蟲出現(xiàn)于36 h, 稚參在72 h出現(xiàn), 120 h稚參比例為26.08% (圖2f)。10 mmol/L所有實驗組和30 mmol/L (6 h)、30 mmol/L (12 h)實驗組中未出現(xiàn)仿刺參幼蟲死亡(圖 2b—f); 而 30 mmol/L(24 h)、50 mmol/L (6 h)、50 mmol/L (12 h)和 50 mmol/L(24 h)實驗組中均出現(xiàn)幼蟲死亡, 死亡率分別為5.56%、23.81%、15.80%和11.11%; 120 h稚參比例為27.78%、9.52%、15.80%和22.22% (圖2g—j)。

在高濃度實驗組中, 500 mmol/L (30 min)實驗組早期五觸手幼蟲出現(xiàn)于24 h, 其它各組出現(xiàn)于12 h,均早于對照組。各實驗組幼蟲均發(fā)生不同程度死亡,其中500 mmol/L (30 min)實驗組120 h幼蟲死亡率最高為47.39%, 稚參比例僅為5.27% (圖3f), 而100 mmol/L(10 min)、100 mmol/L (30 min)、300 mmol/L (10 min)、300 mmol/L (30 min)和 500 mmol/L (10 min)死亡率分別為: 19.99%、26.67%、21.06%、28.57%和22.22%; 120 h稚參比例分別為: 24.99%、33.33%、26.33%、14.29%和 5.56% (圖 3a—e)。

3 討論

仿刺參隸屬于棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirota)、刺參科(Stichopodidae), 主要分布在我國遼寧、山東、河北等北方沿海, 具有極高的營養(yǎng)和藥用價值, 是我國北方沿海重要的經濟種類之一。仿刺參的發(fā)育過程包括受精卵、囊胚、原腸胚、耳狀幼蟲、樽形幼蟲、五觸手幼蟲和稚參等階段。其中, 仿刺參幼蟲從樽形幼蟲發(fā)育到五觸手幼蟲, 由浮游轉變?yōu)榈讞? 完成附著變態(tài), 這一過程也是其幼蟲發(fā)育的最關鍵時期——附著變態(tài)期。該時期的仿刺參幼蟲具有了附著變態(tài)能力, 并且能夠保持一定的時間。此時, 仿刺參幼蟲在誘導因子的誘導下可完成附著變態(tài), 若幼蟲沒有適時附著, 就會發(fā)生延遲變態(tài), 而延遲變態(tài)可能造成其大批死亡(Pechenik, 1990; Li et al, 2010)。在仿刺參苗種生產實踐中, 幼蟲附著變態(tài)率的高低是決定其苗種培育成敗的重要因素。

影響海洋無脊椎動物幼蟲附著變態(tài)的因子很多,包括溫度、鹽度、附著基表面粗糙程度、附著基顏色、溶解氧、流速和光照等物理因子, 也包括神經活性物質、石油類產品、有機溶劑、無機化合物和無機離子等化學因子(張濤等, 2005; Li et al, 2010)。在誘導因子中, KCl價格便宜, 毒副作用小, 在誘導海洋無脊椎動物附著變態(tài)中應用更為廣泛。已有研究表明, KCl可以誘導紅鮑(Haliotis rufescenst)(Baloun et al,1984)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)(Yang et al,1995)、雜色鮑(Haliotis diversicolor)(Bryan et al,1998)、翡翠貽貝(Perna viridis)(柯才煥等, 1998)、方斑東風螺(Babylonia areolata)(楊章武等, 2008)、墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)(張濤等,2003)、葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)(祁劍飛等,2013)和西施舌(Coelomactra antiquate) (陳素文等,2004; 劉文彪等, 2007)等海洋軟體動物幼蟲的變態(tài)發(fā)育。對海灣扇貝(Argopectens irradians)眼點幼蟲誘導變態(tài)的研究發(fā)現(xiàn), KCl濃度為30 mmol/L時, 誘導效果最好(于瑞海等, 2001); KCl對方斑東風螺幼蟲的最佳誘導濃度為11—14 mmol/L(楊章武等, 2008)。而在誘導蝦夷馬糞海膽幼蟲變態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn), KCl的最佳誘導濃度為50 mmol/L(劉春林等, 2008)。

本研究發(fā)現(xiàn) KCl對仿刺參幼蟲附著變態(tài)具有較好的誘導作用, 在10 mmol/L KCl誘導24 h和30 mmol/L KCl誘導12 h、24 h時, 仿刺參幼蟲附著變態(tài)率提高至65%以上, 其中, 在30 mmol/L (24 h)實驗組, 幼蟲附著變態(tài)率最高, 為 71.00%; 在 KCl對仿刺參幼蟲發(fā)育的影響研究中發(fā)現(xiàn)10 mmol/L (12 h)、10 mmol/L (24 h)、30 mmol/L (6 h)、30 mmol/L (12 h)和30 mmol/L (24 h)實驗組仿刺參幼蟲附著變態(tài)率均有提高, 其中30 mmol/L (12 h)實驗組的附著變態(tài)率提高最顯著。燒杯組和六孔板組實驗結果略有不同,可能是餌料差異造成的。已有研究發(fā)現(xiàn)采用不同餌料培育仿刺參幼蟲, 其變態(tài)成活率存在差異(隋錫林,1989)。

圖3 不同濃度KCl溶液處理后各實驗組中不同發(fā)育時期仿刺參幼蟲所占的比例Fig.3 Percentages of A. japonicus larva during different stages of development in experimental groups treated with KCl at different concentrations

本研究中, 適當濃度的 KCl不僅能顯著提高仿刺參幼蟲附著變態(tài)率, 而且能降低幼蟲的死亡率。在30 mmol/L (12 h)實驗組中, 在仿刺參幼蟲發(fā)育120 h后, 附著變態(tài)率高, 且沒有出現(xiàn)幼蟲死亡, 這可能是因為30 mmol/L誘導12 h, 沒有影響仿刺參幼蟲的正常生理發(fā)育, 而且在30 mmol/L (12 h)實驗組中, 仿刺參幼蟲發(fā)育同步性較好。在高濃度實驗組, 仿刺參幼蟲附著變態(tài)大都始于12 h, 早于對照組的附著變態(tài)時間24 h。高濃度的KCl也可誘導仿刺參幼蟲變態(tài)發(fā)育, 雖然處理時間短, 但經過高濃度的 KCl誘導后,幼蟲出現(xiàn)了較高死亡率, 導致幼蟲附著變態(tài)率低。高濃度KCl可能影響了幼蟲正常的生長和發(fā)育。綜合考慮仿刺參幼蟲附著變態(tài)率、發(fā)育同步性和死亡率等因素, 30 mmol/L (12 h)實驗組誘導效果比較理想。

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