潘 娜 苗 亮 李明云① 郭曉飛 趙 亮 陳 炯 張玉明 呂益龍

(1. 寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室 寧波 315211; 2. 浙江新昌水利水電局 新昌 312500)

在魚類分類和鑒定中, 傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法有一定的局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)方法的發(fā)展, 基于核苷酸序列分析的分子系統(tǒng)學(xué)已成為生物分類和系統(tǒng)發(fā)育研究中的一種重要方法。在各種分子標記中,線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)具有分子結(jié)構(gòu)簡單、幾乎不發(fā)生重組、呈母系遺傳、進化速度快等特點, 已經(jīng)成為分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛和有效的分子檢測標記之一(肖武漢等, 2000; 趙凱,2006)。同時由于mtDNA的特點, 利用其檢測地理隔離在魚類群體間產(chǎn)生的遺傳差異, 已成為近年來魚類分子遺傳學(xué)研究的熱點之一(Danzman et al, 1991;楊金權(quán)等, 2003; Liu et al, 2010)。盡管傳統(tǒng)的形態(tài)標記、同工酶分析等已成功應(yīng)用于魚類種群的識別, 但對于多數(shù)魚類來說, 仍難以揭示出一些重要的遺傳變異, 而 mtDNA的豐富變異可作為類群識別的基礎(chǔ)(郭新紅等, 2004)。為了獲得比較準確的物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 近年來研究者一般采用多個分子標記相結(jié)合的方法構(gòu)建比較客觀的系統(tǒng)進化樹(陳四海等,2011)。本研究擴增了浙江新昌光唇魚的線粒體COⅡ和 D-loop序列并進行分子系統(tǒng)發(fā)育和進化樹分析,結(jié)合形態(tài)特征觀察, 探討新昌光唇魚的分類地位, 研究結(jié)果可為光唇屬魚類的分類提供理論依據(jù), 并為今后新昌光唇魚資源的開發(fā)和利用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年 6月從浙江省新昌縣山澗溪流中采捕野生光唇魚樣本共14尾, 每尾個體均用HT157型動物標簽(廣州洪騰條碼技術(shù)有限公司)進行活體標記后剪取少量尾鰭, 液氮速凍后–80°C保存用于提取DNA。

1.2 方法

對新昌光唇魚進行外部形態(tài)的觀察; 然后對其進行常規(guī)的測量, 包括頭長、體高、吻長、眼后頭長、眼間距、眼徑、背鰭式、臀鰭式、側(cè)線鱗、鰓耙。測量數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析。

以常規(guī)酚-氯仿法從鰭條中提取DNA (Sambrook et al, 1989)。根據(jù)溫州光唇魚(A. wenchowensis)線粒體全序列(GenBank登錄號: NC_020145)設(shè)計COⅡ擴增引物; 使用黃志堅等(2010)設(shè)計的魚類D-loop擴增引物, 引物序列見表1。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR擴增體系為: 2×Taq Premix-Dye 10μL (上海博彩生物科技有限公司), DNA 模板 2μL (50—100ng/μL), 正、反向引物各 1μL, 加 ddH2O 至 20μL。擴增程序為: 94°C變性 5min; 94°C變性 40s, 退火1min(退火溫度見表 1), 72°C延伸 1min, 循環(huán) 30次;72°C延伸 10min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

表1 COⅡ和D-loop序列擴增引物Tab.1 The amplification primers of COⅡand D-loop sequences

用膠回收試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)回收PCR產(chǎn)物, 與pMD-19載體(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞, 藍白斑篩選后挑取陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

用 Clustal X軟件對獲取的浙江新昌光唇魚 COⅡ、D-loop序列與GenBank中獲取的其它鯉科魚類COⅡ和 D-loop序列(表 2)進行多重比對; 用 MEGA 4.0軟件(Tamura et al, 2007)進行各堿基含量和變異情況分析, 用Kimura 2-parameter模型計算序列遺傳距離, 并以鱸魚(Lateolabrax japonicus, 登錄號為NC_018045)為外群, 構(gòu)建鄰接法(NJ)分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2.1 外部形態(tài)特征

采集的浙江新昌野生光唇魚見圖 1。經(jīng)觀察, 魚體長而側(cè)扁, 腹部比較平直或稍呈弧形, 背部上半部分為灰黑色, 下半部分有的帶點黃色, 腹面為白色;鼻孔前略成凹陷, 頭長[(2.5±0.2)cm]小于體高[(2.6±0.3)cm]。吻鈍圓, 向前突出, 吻長[(0.9±0.1)cm]小于眼后頭長[(1.1±0.1)cm]; 口下位, 口裂呈淺馬蹄形,上唇稍薄, 緊貼于上頜外表, 下唇分兩側(cè)瓣, 較臃腫,中央相互接觸; 須兩對, 口角須略長于眼徑, 吻須稍短; 眼間隆起, 間距[(1.3±0.1)cm]遠大于眼徑[(0.5±0.1)cm]。光唇魚的背鰭式為DⅡ-9, 背鰭末跟不分枝,背鰭膜間有黑色斑紋; 臀鰭式為A-6; 側(cè)線鱗為39—42(6/A4—5), 側(cè)線上有副孔; 鰓耙數(shù)為14—15。有的體側(cè)有6條垂直條紋, 第二條垂直條紋起點位于背鰭起點下方, 向下延伸至腹部; 有的則隱約在尾鰭附近有1—2條垂直條紋; 而有的則沒有垂直條紋。

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圖1 采自浙江省新昌縣溪流的光唇魚Fig.1 Acrossocheilusi fish sampled from the rivers and creaks in Xinchang, Zhejiang

2.2 新昌光唇魚COⅡ和D-loop序列特征

經(jīng)測序, COⅡ引物在浙江新昌光唇魚中的擴增產(chǎn)物長度為 775bp, 其中 COⅡ基因序列全長均為691bp; 14尾新昌光唇魚的 COⅡ序列相似度為99.94%, 只存在 6個位點的堿基轉(zhuǎn)換, 其中 T/C和A/G轉(zhuǎn)換位點各3個。新昌光唇魚COⅡ序列中堿基A、T、G、C的平均組成分別為 31.20%、26.40%、15.30%和27.10%, A+T含量(57.60%)高于G+C含量(42.40%); COⅡ序列的堿基組成均有明顯的偏向性,G的含量明顯低于其它三種堿基。

D-loop引物在新昌光唇魚中的擴增產(chǎn)物長度為1112—1118bp, 其中 D-loop基因序列全長為 933—939bp; 新昌光唇魚群體 D-loop序列的相似度為99.38%, 有22個轉(zhuǎn)換(A-G、T-C)位點、3個顛換(A-C、A-T)位點和 8個插入或者缺失(A、T)位點; 其中堿基A、T、G、C的平均組成分別為34.50%、31.20%、12.80%和21.50%, A+T含量(65.70%)大于G+C含量(34.30%);D-loop序列中也是G的含量明顯低于其它三種堿基。

浙江新昌光唇魚的COⅡ基因均編碼230個氨基酸, 都含有一個起始密碼子 ATG和不完全的終止密碼子T。其 COⅡ和D-loop遺傳距離見表3, 其中新昌光唇魚群體內(nèi)COⅡ、D-loop基因的平均遺傳距離分別為0.003、0.005; 與表2中其它鯉科魚類的遺傳距離分析結(jié)果顯示, 浙江新昌光唇魚與溫州光唇魚(A. wenchowensis)的遺傳距離最近, COⅡ、D-loop序列遺傳距離分別為0.000、0.011。

2.3 基于COⅡ和D-loop序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2為基于COⅡ序列的新昌光唇魚及其它鯉科魚類的鄰接法(NJ)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹, 結(jié)果顯示:光唇魚屬和白甲魚屬的 12種魚聚為一個大簇; 其中溫州光唇魚與新昌光唇魚形成一個緊密的簇, 二者親緣性非常近, 序列比對顯示其 COⅡ序列同源性達到 99.94%。之后再與半刺光唇魚、多彩鲃、臺灣鏟頜魚、白甲魚、粗須白甲魚、小口白甲魚和多鱗白甲魚聚為一簇; 而寬口光唇魚、稀有白甲魚和高身白甲魚三者則單獨聚為一簇。另外, 鯉科的各亞科形成 2個大簇, 其中鲃亞科、鯉亞科與野鯪亞科聚為一個大簇, 而鮈亞科、雅羅魚亞科、鰍鮀亞科、鲴亞科與鲌亞科聚為另一個大簇。另外, 鯉科的鰟鰟亞科與外類群鱸魚形成一簇。

圖2 基于鯉科魚類線粒體DNA COⅡ序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree on COⅡsequences of Cyprinidae fishes constructed by Neighbore-Joining method Bootstrap=1000, 支持率＜50%的未顯示, ZJxinchang表示浙江新昌光唇魚

圖3為基于D-loop序列的新昌及其它鯉科魚類的鄰接法(NJ)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹, 結(jié)果顯示: 新昌光唇魚與溫州光唇魚形成一個緊密的簇, 序列比對顯示其D-loop序列同源性達到99.36%; 光唇魚屬和白甲魚屬分別相聚后再聚為一簇, 但稀有白甲魚和高身白甲魚聚在光唇魚屬的簇中; 鯉科的各亞科形成2個大簇, 其中鲃亞科、鯉亞科與野鯪亞科聚為一簇, 而亞科、雅羅魚亞科、鰍亞科、鳑鲏亞科、鲴亞科與鲌亞科聚為另一簇。

3 討論

目前對光唇魚類的種類劃分仍存在一定分歧,如伍獻文(1977)鑒定了 19個種和亞種, 并且根據(jù)下唇側(cè)瓣的位置不同, 將其劃分為光唇魚亞屬(Acrossocheilus)和厚唇魚亞屬(Lissochilichthys)兩個亞屬; Kottelat(2000)則將光唇魚屬劃分為有垂直條紋和無垂直條紋的兩個類群, 并認為有垂直條紋類群是狹義的光唇魚屬, 無垂直條紋的種類可能屬于吻孔鲃屬(Poropuntius); 袁樂洋(2005)也認為無垂直條紋類群可能不屬于光唇魚屬。另外, 趙俊等(1997)根據(jù)沅江的標本描述了光唇魚屬新種吉首光唇魚(A.jishousesis), 袁樂洋(2005)也認為吉首光唇魚是一個有效的種, 但單鄉(xiāng)紅等(2000)的《中國動物志》中卻未確立其物種有效性。究其原因, 一方面光唇魚屬魚類分布在中國長江以及長江以南各個水系, 且有些物種在多個水系中均有分布, 環(huán)境因子會造成種內(nèi)的不同地理群體間產(chǎn)生一些差異, 再加上種內(nèi)個體變異、雌雄兩性差異以及傳統(tǒng)形態(tài)特征測量中的人為誤差, 往往會使物種鑒定工作變得異常困難, 并且容易產(chǎn)生鑒定錯誤(袁樂洋, 2005)。本研究中的新昌光唇魚具有光唇魚屬魚類的基本特征, 如唇肉質(zhì), 包于上下頜外表, 下唇分兩側(cè)瓣, 須兩對, 背鰭末根不分枝等, 從形態(tài)特征上來看, 新昌光唇魚與已明確種的溫州光唇魚(A. wenchowensis)最為相似。但根據(jù)袁樂洋(2005)的描述, 溫州光唇魚(A. wenchowensis)的雄魚艱眶骨前緣有珠星分布, 雌魚無珠星; 雄魚垂直條紋僅限于側(cè)線以上, 沿側(cè)線有一條明顯的黑色縱紋,雌魚縱紋隱約可見, 而采集的 14尾新昌光唇魚都有珠星, 有些沒有垂直條紋, 故單憑外部形態(tài)特征難以準確對新昌光唇魚進行判定。

圖3 基于線粒體DNA D-loop序列構(gòu)建的鯉科NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree on D-loop sequences of Cyprinidae fishes constructed by Neighbore-Joining method Bootstrap=1000, 支持率＜50%的未顯示, ZJxinchang表示浙江新昌光唇魚

線粒體DNA是細胞質(zhì)中具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的閉合環(huán)狀雙鏈 DNA, 包括一條重鏈和一條輕鏈(李殿香, 2000)。mtDNA具有分子結(jié)構(gòu)簡單、幾乎不發(fā)生重組等特點, 已經(jīng)成為分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要標記(肖武漢等, 2000)。其中細胞色素氧化酶亞基Ⅱ(COⅡ)是線粒體 13種編碼基因之一, 已有較多使用COⅡ序列對魚類進行系統(tǒng)進化和分類研究的報導(dǎo), 如凌去非等(2006)對25種鯉科魚類的COⅡ系統(tǒng)進化分析顯示雅羅魚亞科可分為北方和東亞兩個類群, 北方類群形成一單系群, 而東亞類群則與鲌亞科、鲴亞科、鰱亞科合為一單系群, 并推斷鲌亞科、鲴亞科、鰱亞科可能是由原始的雅羅魚亞科魚類在東亞派生的類群; D-loop區(qū)域是線粒體中唯一的非編碼區(qū), 不受選擇壓力的影響, 進化速度比較快, 遺傳變異較大, 適合于近緣種及種內(nèi)不同群體間的遺傳差異分析(Rosel et al, 1995; Gatt et al, 2000; Zrdoya et al,2000; 陳姝君等, 2008), 如Murakami等(2001)分析了日本169個鯽魚(Carassius auratus)個體的D-loop序列, 證明了傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)將白鯽(Carassius auratus cuvieri)定位為鯽魚的一個亞種的論斷。這些研究結(jié)果都表明基于線粒體COⅡ和D-loop序列的系統(tǒng)發(fā)育分析可以成為傳統(tǒng)依據(jù)形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征進行物種分類的有效補充。

在基于COⅡ和D-loop序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹中,新昌光唇魚均與溫州光唇魚(A. wenchowensis)形成一個緊密的簇, 二者 COⅡ、D-loop序列的相似性分別為99.94%和99.36%、遺傳距離分別為0.000和0.011,均小于 Nei(1987)提出的種間遺傳距離大于 0.050的標準, 因此斷定浙江省新昌縣采集的光唇魚與溫州光唇魚(A. wenchowensis)為同一種, 但新昌光唇魚和溫州光唇魚(A. wenchowensis)模式種在形態(tài)上有一些不同, 可能是由于環(huán)境因素造成的不同地理群體間的差異, 如袁樂洋(2005)描述的浙江和福建兩地不同地理群體的溫州光唇魚(A. wenchowensis)存在較大差別, 差別主要在福建群體體側(cè)有 5—6條與體軸垂直的黑色條紋, 浙江群體則有6條垂直條紋, 前者第二條垂直條紋起點位于背鰭末根不分支鰭條基部之后,后者第二條垂直條紋起點位于背鰭起點處等, 而本研究中的新昌群體則有些有6條垂直條紋, 第二條垂直條紋起點位于背鰭起點處, 有的則隱約在臀鰭與尾鰭之間有1—2條垂直條紋, 而有些沒有垂直條紋。

本研究所作的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示光唇魚屬與白甲魚屬有較近的親緣關(guān)系, 這與 Wang等(2007)的RAG2序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。但系統(tǒng)樹中兩個屬的有些種類混雜在一起, 究竟是這些種類有共同的進化起源還是樣本采集時的物種鑒定問題, 仍有待進一步深入研究。

光唇魚作為一種新興的小型淡水經(jīng)濟魚類, 具有較大的開發(fā)利用價值。筆者在形態(tài)特征觀察的基礎(chǔ)上, 通過擴增COⅡ和D-loop序列并進行序列比對和系統(tǒng)樹分析, 確定了新昌光唇魚和溫州光唇魚(A.wenchowensis)為同一種, 且為二個不同的地理群體,這既有助于今后新昌光唇魚的資源開發(fā)利用, 又可為研究光唇魚類的分類提供參考資料。

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