曹翠翠 趙鳳琴 郭少茹 王宏偉

(遼寧師范大學生命科學學院 大連 116081)

細弱蜈蚣藻(Grateloupia tenuis Wang et Luan)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、杉藻目(Gigartinales)、海膜科(Halymeniaceae)、蜈蚣藻屬(Grateloupia C. Agardh),是作者基于形態(tài)觀察和 rbcL基因序列分析發(fā)現(xiàn)并報道的產(chǎn)自海南省陵水新村(18.4°N, 109.9°E)的一個新種。該種的主要特征為: 藻體紫紅色, 單生或叢生,線型, 光滑, 軟骨質(zhì), 高約4—7cm。主枝呈圓柱形或亞圓柱形, 直徑約 0.5—1mm; 分枝互生或偏生, 或呈 2—3回叉狀分枝, 直徑約 0.2—0.6mm, 有的分支頂端生有3至多個小育枝。藻體基部略微縊縮, 形成小的短柄, 柄長約1.6—2.6cm, 具有小盤狀的固著器,用于固著在巖石或貝類等上。藻體橫切面觀, 由皮層和髓部構(gòu)成。皮層由外皮層和內(nèi)皮層構(gòu)成, 皮層厚度為20—40μm; 外皮層由5—6層橢圓形或圓形細胞構(gòu)成, 細胞長 3—6μm, 寬 2—5μm, 排列緊密; 內(nèi)皮層由 3—4層卵圓形或圓形的長 6—13μm、寬 4—7μm的細胞構(gòu)成, 排列疏松。髓部幼嫩時是實心的, 由縱橫交錯的髓絲構(gòu)成, 緊密纏繞在一起, 髓絲長 11—17μm, 寬 1—2μm, 成熟后變成中空。雌配子體的果胞枝和輔助細胞由不同的生殖枝叢形成, 且均始于內(nèi)皮層細胞。果胞枝由果胞枝生殖枝叢形成, 果胞枝為2個細胞, 包括果胞和下位細胞, 果胞末端有一條長受精絲。輔助細胞由輔助細胞生殖枝叢形成, 與果胞枝生殖枝叢相似, 每一個輔助細胞生殖枝叢只形成一個輔助細胞, 極少情況下形成兩個; 輔助細胞與一般生殖枝叢細胞類似, 但是個體較大, 原生質(zhì)較濃。四分孢子囊由四分孢子體的皮層細胞形成, 呈十字形分裂, 成熟的四分孢子囊長 10—16μm, 寬 6—8μm。生于中、低潮帶的巖礁或石沼中(Yu et al,2013)。

關(guān)于細弱蜈蚣藻的研究目前只限于上述新種的描述和報道, 關(guān)于生長、發(fā)育、生活史以及經(jīng)濟價值等研究目前未見報道。為了補充相關(guān)內(nèi)容, 筆者探討了主要環(huán)境因子(溫度和光照強度)對其孢子的萌發(fā)、盤狀體形成和直立枝生長的影響, 同時追蹤了細弱蜈蚣藻生活史的各個階段, 明確了生活史構(gòu)成及其類型。為細弱蜈蚣藻種質(zhì)保存、人工育苗和養(yǎng)殖以及可持續(xù)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本采集

本實驗中用于培養(yǎng)的細弱蜈蚣藻由魏成湘于2012年5月5日采集于海南省陵水新村低潮帶的巖石上或者石沼中。

將采集到的具有成熟囊果的雌配子體和具有四分孢子囊的四分孢子體活體置于盛有海水的保溫箱中, 密封, 空運回實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 首先將采集來的藻體用海水反復沖洗, 在解剖鏡下用毛刷輕輕刷洗, 以去除藻體表面的微小生物和硅藻等雜藻。從中挑選出具有囊果的雌配子體和具有四分孢子囊的四分孢子體藻體進行培養(yǎng)。充氣暫養(yǎng)于消毒海水內(nèi), 暫養(yǎng)條件溫度為24°C,光照強度 120μmol/(m2s) ,光期為(L):暗(D)＝12:12。將暫養(yǎng)的帶囊果的雌配子體和具有四分孢子囊的四分孢子體, 放入底部鋪滿載玻片的培養(yǎng)皿(60mm×15mm)中, 倒入消毒海水并使藻體浮在玻片的上方,待果孢子和四分孢子放散。

經(jīng)過24h的培養(yǎng), 大量果孢子和四分孢子放散并附著到載玻片(10mm×10mm)上, 當視野(10×10 倍)中附著的果孢子和四分孢子數(shù)達到大約 30個左右時,將藻體移除, 并將海水倒掉, 向培養(yǎng)皿中加入 2/3體積的PES培養(yǎng)液, 使釋放的果孢子和四分孢子在PES培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng), 另加入GeO2(2mg GeO2/1000mL PES) 以防止附生硅藻及其它雜藻的生長。

1.2.2 培養(yǎng)溫度和光照強度的設置 果孢子和四分孢子附著后, 將盛有載玻片的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到光溫控制的生物培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

溫度設置分別為: 4、9、14、19、24、30°C六個梯度, 光照強度 120μmol/(m2s), 光照周期為光(L):暗(D)＝12:12。

光照強度梯度分別設置為: 10、40、70、120、150、200μmol/(m2s), 光照周期為光(L):暗(D)＝12:12, 溫度 24°C。

1.2.3 發(fā)育過程的觀察與統(tǒng)計 把裝有附著果孢子和四分孢子的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)液每3天更換1次。

當盤狀體表面生長出直立枝后, 將其轉(zhuǎn)移至10cm×10cm×5cm滅菌的培養(yǎng)缸中, 進行成熟培養(yǎng)。

每日取出載玻片, 用 Olympus BH2數(shù)碼相機(Olympus Beijing Co Ltd, China) 進行顯微拍照并記錄。每隔6天對果孢子和四分孢子的發(fā)育情況拍照記錄一次, 并測量其發(fā)育成盤狀體和直立枝的直徑。每個實驗組設置3個平行, 每個平行實驗組中隨機抽取5個盤狀體并測量其直徑。利用公式 RGR(%)=[ln(Dt/D0)/t]×100% 求得其盤狀體的相對生長速率。其中D0為盤狀體初始直徑, t為培養(yǎng)天數(shù), Dt為培養(yǎng)t天后盤狀體直徑。

2 結(jié)果

2.1 細弱蜈蚣藻果孢子的發(fā)育過程

細弱蜈蚣藻的雌配子體在皮層內(nèi)形成囊果, 突出于藻體表面(圖 1a)。經(jīng)過 24h, 成熟的果孢子由囊孔釋放并附著在載玻片上。細弱蜈蚣藻的果孢子呈紅褐色, 球形或橢球形, 直徑為 5—12μm(圖 1b)。果孢子釋放 24h, 開始萌發(fā)。首先果孢子的一端膨脹并形成突起, 突起慢慢伸長形成萌發(fā)管, 萌發(fā)管的顏色比孢子稍淺; 萌發(fā)管延長的同時, 孢子的內(nèi)容物逐漸移向萌發(fā)管的一端; 當內(nèi)容物全部移向萌發(fā)管一端后,孢子細胞變空后形成新的基本細胞(圖1c—e)。

3—4天后, 基本細胞開始進行不規(guī)則分裂, 出現(xiàn)兩種情況: 一種情況是基本細胞原地分裂, 然后形成盤狀體; 第二種情況是基本細胞首先分裂形成絲狀體, 然后在絲狀體一端分裂形成掃帚狀, 最后形成圓盤狀的盤狀體。盤狀體繼續(xù)分裂生長, 不斷擴大,直徑可達到大約250μm左右(圖1f—i)。

盤狀體的一端突出形成小芽, 30天左右, 小芽長成直立枝。一個盤狀體上可長出多個直立枝。直立枝繼續(xù)生長形成幼苗(圖1j—m)。

四分孢子的發(fā)育與果孢子發(fā)育情況基本相似。

2.2 溫度對孢子(果孢子)發(fā)育的影響

圖2和圖3表明在不同溫度條件對盤狀體形成和直立枝的影響。溫度為4°C和9°C時, 果孢子不萌發(fā),沒有盤狀體和直立枝的形成。

溫度在 14—24°C范圍時, 果孢子均可以萌發(fā),盤狀體均可以長出直立枝, 而長出直立枝的時間有所不同。

溫度在24°C左右時, 果孢子經(jīng)過3—4天即可形成盤狀體, 盤狀體直徑增長最快。第6天測量其直徑為50μm; 第30天時直徑達到254μm。在第24天時,盤狀體直徑長到200μm左右時, 直立枝開始生長。第36天時直立枝的長度為113μm; 第42天時為321μm,細長絲狀的形態(tài)特征明顯; 到第 60天時, 直立枝長度已經(jīng)有1cm左右。

圖1 細弱蜈蚣藻果孢子的發(fā)育過程Fig.1 The development of carpospores in G. tenuis

溫度為 30°C時, 果孢子有少許萌發(fā), 盤狀體形成緩慢。

取培養(yǎng) 30天的盤狀體直徑計算其相對生長速率。在溫度為24°C時細弱蜈蚣藻盤狀體的相對生長速率達到最大, 為 5.34%; 溫度為 19°C 條件下的4.94%; 溫度為 14°C 條件下的 3.87%。溫度為 30°C條件下的2.47%。

在研究不同溫度條件對四分孢子發(fā)育的影響實驗中, 與果孢子的研究結(jié)果相同。

圖2 30天內(nèi)不同溫度對盤狀體的生長直徑的影響Fig. 2 Effects of temperature on the diameter of discoid crusts in 30 days

圖3 60天內(nèi)不同溫度對直立枝生長的影響Fig. 3 Effects of temperature on the growth of upright thalli in 60 days

2.3 光照強度對孢子(果孢子)發(fā)育的影響

圖4和圖5表示在設定的光周期和溫度條件下,不同的光照強度對盤狀體形成和直立枝生長的影響。在光照強度為 10、40、70、120、150、200 μmol/(m2s)條件下, 果孢子都可以萌發(fā), 形成盤狀體。在光照強度為10、40及200μmol/(m2s)時, 盤狀體發(fā)育異常緩慢。未見直立枝形成。

在光照強度為 70μmol/(m2s), 盤狀體發(fā)育成直立枝的時間是在培養(yǎng)36天后有直立枝的出現(xiàn)。

在光照強度為 120—150μmol/(m2s)的培養(yǎng)條件下果孢子在3天左右即可發(fā)育成盤狀體, 在第20天左右即可長出直立枝。此時盤狀體和直立枝生長速度最快。

盤狀體的相對生長速率在 120μmol/(m2s)條件下最大(4.56%), 其次是光照強度為 150μmol/(m2s)(3.72%)、70μmol/(m2s)條件下(3.14%), 200μmol/(m2s)條件下生長速率最低(0.09%)。其相對生長速率在 70—120μmol/(m2s)隨著光照強度的提高呈上升趨勢。在光照強度大于 150μmol/(m2s)有下降的趨勢。而直立枝的生長速率 120＞150＞70＞200μmol/(m2s)。在光照強度為10—40μmol/(m2s), 直立枝未見。

在研究不同溫度條件對四分孢子發(fā)育的影響實驗中, 與果孢子的研究結(jié)果相同。

圖4 30天內(nèi)不同光照強度對盤狀體生長直徑的影響Fig. 4 Effects of light intensity on the diameter of discoid crusts in 30 days

圖5 60天內(nèi)不同光照強度下直立枝生長的影響Fig. 5 Effects of light intensity on the growth of upright thalli in 60 days

2.4 細弱蜈蚣藻的生活史

圖6所示為細弱蜈蚣藻的生活史, 由單倍體的配子體、二倍體的四分孢子體和果孢子體構(gòu)成, 屬于同型世代交替。配子體為雌雄異體, 雌配子體的內(nèi)皮層細胞形成果胞枝生殖枝叢和輔助細胞生殖枝叢, 果胞枝生殖枝叢的主枝由4—8個稍球形或橢圓形的細胞組成, 有2—4分枝, 每個分枝亦由數(shù)個細胞組成。枝叢上產(chǎn)生的果胞枝, 皆為2個細胞組成, 即果胞和下位細胞; 輔助細胞生殖枝叢的形狀與前者相似, 主枝由 5—13個橢圓形或稍球形細胞構(gòu)成, 有 2—4個分枝, 每個分枝由4—11個細胞構(gòu)成; 輔助細胞也由其枝叢的細胞產(chǎn)生, 呈球形, 比周圍的細胞大, 內(nèi)充滿原生質(zhì)。雄配子體的外皮層細胞形成精子囊, 圓珠狀, 無色; 精子通過受精絲與果胞結(jié)合, 受精后的果胞與下位細胞溶合, 形成溶合胞, 溶合胞通過聯(lián)絡絲由果胞枝生殖枝叢出發(fā)到達輔助細胞。接受合子后的輔助細胞首先橫分裂產(chǎn)生第一個產(chǎn)孢絲細胞, 然后繼續(xù)橫分裂或縱分裂產(chǎn)生更多的產(chǎn)孢絲細胞。同時,其它生殖枝叢細胞也開始分裂產(chǎn)生更多的小球狀或絲狀細胞, 并與周圍的髓絲混雜, 圍繞產(chǎn)孢絲細胞,最終形成一個絲狀囊果被。產(chǎn)孢絲末端首先成熟, 每個細胞形成近球形的果孢子囊。果孢子囊與其四周包圍的囊果被形成球形的囊果, 成熟的囊果埋于皮層中, 頂端有一小孔, 均勻散布在藻體表面, 呈顆粒狀。果孢子囊成熟后, 果孢子由囊孔溢出藻體外。果孢子經(jīng)過萌發(fā)形成盤狀體, 隨著培養(yǎng)時間的延長, 直徑不斷增長的盤狀體進一步發(fā)育形成直立芽體直至孢子體的營養(yǎng)細胞, 生長成為四分孢子體。四分孢子體上形成四分孢子囊, 成熟的四分孢子囊長 10—16μm, 寬 6—8μm。呈十字形分裂, 形成四分孢子。四分孢子萌發(fā)分別形成雌雄配子體。

圖6 細弱蜈蚣藻的生活史Fig.6 The life history of G. tenuis

3 討論

在溫度影響盤狀體形成和直立枝生長實驗中,溫度低于9°C和高于30°C條件下未見盤狀體的形成,直立枝也未見。盤狀體形成和直立枝生長的耐溫范圍為 14—24°C, 其中溫度為 14—19°C 條件下, 盤狀體直徑的生長相對速率緩慢, 而其中最適生長溫度是24°C, 相對生長速率達到最大。這與細弱蜈蚣藻采集于自然分布亞熱帶的海水溫度極為接近。溫度是影響大型海藻生長和地理分布的重要環(huán)境因子, 這已在許多研究結(jié)果中得到證實(劉靜雯等, 2001; 鄧蘊彥等,2011)。如舌狀蜈蚣藻適合果孢子發(fā)育為盤狀體的條件為溫度 25°C(陳偉洲等, 2013); 蜈蚣藻和帶形蜈蚣藻(G. turuturu)的盤狀體生長的適宜溫度在20°C之上(馬凌波等, 1995); 條滸苔生長的適宜溫度為15—25°C, 過高或過低的溫度都不利于條滸苔的生長(張寒野等, 2006); 溫度超過適宜的范圍, 藻體的生長受到抑制, 這可能與生長相關(guān)的酶活性下降有關(guān)。生物體內(nèi)酶開始失活, 生化反應將不能正常進行(徐年軍等, 2009)。武寶玕等(2002)對帶形蜈蚣藻的熱脅機制的研究得出, 高溫脅迫使藻膽體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 最后導致PSII受體側(cè)活性受抑。本研究只是初步探討了溫度對細弱蜈蚣藻的盤狀體形成和直立枝生長的情況, 有關(guān)高溫脅迫細弱蜈蚣藻的機制還有待進一步探究。

光照強度也對細弱蜈蚣藻盤狀體形成和直立枝生長有影響, 在高光照強度下較低光照強度條件下發(fā)育更快。但過高的光照強度會抑制盤狀體發(fā)育和直立枝生長。適合光照強度為120—150μmol/(m2s)。在一年四季中, 高溫往往伴隨著高光照強度。夏季高溫而且光照強度大, 冬季低溫且光照強度弱。這可能與藻體的生長環(huán)境有關(guān), 培養(yǎng)的細弱蜈蚣藻采集于海南陵水的低潮帶的巖石上或石沼中。隨著溫度的增加,光照強度也增加, 海水溫度和空氣溫度接近?？梢?高光照強度更適合細弱蜈蚣藻的生長。例如條滸苔生長適宜光照強度 60μmol/(m2s)左右, 過高的光照強度會破壞藻體色素體的形成, 從而影響條滸苔的生長(張寒野等, 2006)。本實驗研究證明了細弱蜈蚣藻的最適光照強度為120μmol/(m2s), 有關(guān)光照強度影響細弱蜈蚣藻的機制會在以后的研究中進一步探討。

藻類的孢子發(fā)生類型及孢子形態(tài)、大小等生物學特征也是研究紅藻分類的依據(jù)之一(豬野俊平, 1947)。有研究表明廈門地區(qū)沿海產(chǎn)的蜈蚣藻和繁枝蜈蚣藻(G. ramosissima)的孢子發(fā)生類型均為間接盤狀型(劉鳳賢等, 1986); 蜈蚣藻 G. filicina (Lamouroux) C.Agardh(現(xiàn)為 G. asiatica Kawaguchi et Wang)的孢子發(fā)育形式為間接盤狀型, 有時也以間接絲狀型類似的發(fā)生型出現(xiàn)(豬野俊平, 1947), 這在本實驗結(jié)果中也有所體現(xiàn)。對細弱蜈蚣藻的發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn): 細弱蜈蚣藻的孢子發(fā)育類型為間接盤狀型。同時細弱蜈蚣藻的生活史為同型世代交替, 因為二倍體的孢子體和單倍體的配子體在形態(tài)上完全相同。生活史由二倍體四分孢子體、單倍體的配子體和二倍體的果孢子體構(gòu)成, 與屬模蜈蚣藻的生活史類型相同。這也和裴魯青(1983)研究的浙江滑溜蜈蚣藻(現(xiàn)為帶形蜈蚣藻 G.turuturu)的生活史類型一樣。孢子的發(fā)育類型和生活史也為細弱蜈蚣藻的分類地位提供了有利依據(jù)。

蜈蚣藻屬海藻種類繁多, 很多種類具有很高的經(jīng)濟價值、食用價值, 例如帶形蜈蚣藻可以食用并且具有很高的營養(yǎng)價值(Wang et al, 2012); 在藥用方面有些種類具有抗腫瘤作用(李雅琪等, 2010; 張治業(yè),2011)、抗病毒作用(芮雯等, 2006; 朱艷梅等, 2006)、抗凝血作用(Sen et al, 1994; Lee et al, 2008)、增強免疫力(郭朝華等,1996); 在工業(yè)用途方面, 舌狀蜈蚣藻(G. livida)瓊脂含量豐富, 可以做瓊膠的工業(yè)原料(Xia et al, 1983; 史升耀, 1985; Chen et al, 1994)。而細弱蜈蚣藻隸屬于蜈蚣藻屬, 并且與上述種類親緣關(guān)系較近(Yu et al, 2013), 相信該種也應具有很高的食用、藥用或工業(yè)用等價值, 所以對該種的研究還需進一步的深入, 以期在豐富我國海藻多樣性的同時,對該種的種質(zhì)保存和可持續(xù)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

致謝衷心感謝魏成湘標本采集。

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