胡劼，李華，焦明克，段瀚宇

我國(guó)新疆地區(qū)有帕米爾、阿里兩大高原，有喀喇昆侖山、昆侖山、天山等多個(gè)平均海拔5000m以上的山系，高海拔地區(qū)總面積可達(dá)60萬平方千米，這些地區(qū)空氣稀薄，氧含量低，是高原缺氧疾病的高發(fā)地帶。研究顯示，當(dāng)母體處于低氧環(huán)境，動(dòng)脈氧分壓降為40mmHg時(shí)，其體內(nèi)胎兒的動(dòng)脈氧分壓可降至10～12mmHg，造成胎兒缺氧狀態(tài)[1]。這種狀態(tài)不僅造成胎兒血流和體內(nèi)氧分子的重新分布，還可導(dǎo)致胎兒發(fā)生缺氧應(yīng)激反應(yīng)[2]，引發(fā)多種器官組織病理改變，從而引起胎兒生長(zhǎng)受限、發(fā)育異常。研究還顯示，許多慢性成人疾病具有“胎兒起源”，即妊娠期缺氧會(huì)影響后代發(fā)展，增加后代在成年期患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓及糖尿病等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]，但目前還缺乏有效的研究妊娠期缺氧母體及胎兒改變的動(dòng)物模型。為此本研究應(yīng)用西北人工實(shí)驗(yàn)艙建立妊娠期綿羊不同程度高原缺氧模型，并進(jìn)行缺氧指標(biāo)及氧化損傷標(biāo)志物的檢測(cè)，評(píng)估判斷該造模方法的可行性并初步探討高原低氧環(huán)境對(duì)妊娠期母體及胎兒的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 西北地區(qū)特殊環(huán)境實(shí)驗(yàn)艙(DYC-3013M)由蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院研制。分光光度計(jì)(ND-NDL-US-CAN)、熒光計(jì)(FM 109534)購(gòu)自Thermofisher公司。丙二醛TBARS定量分析試劑盒(STA-330)購(gòu)自Cell BioLabs公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及高原缺氧模型制備 人工授精配種成功的妊娠期綿羊24只，體重25～35kg，由蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將24只妊娠期綿羊隨機(jī)分為平原對(duì)照組(low altitude control group，LAC)組、輕度低氧暴露組(m ild hypoxia exposure group，MHE)組及重度低氧暴露組(severe hypoxia exposure group，SHE)共3組(n=8)。LAC組于平原環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙飼養(yǎng)，低氧暴露組于低壓高寒環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙中飼養(yǎng)，期間動(dòng)物均自由飲水進(jìn)食，MHE和SHE組均每隔24h開艙30m in添加水及飼料，低氧暴露持續(xù)整個(gè)妊娠期。其中，LAC人工實(shí)驗(yàn)艙溫度為20℃，濕度11.0g/m3，O2含量260g/m3，壓力100.0kPa；MHE人工實(shí)驗(yàn)艙溫度為5℃，濕度3.68g/m3，O2含量206g/m3，壓力67.7kPa，調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)高度以10m/s的速度勻速上升至海拔3000m水平，以模擬西北地區(qū)海拔3000m環(huán)境；SHE人工實(shí)驗(yàn)艙溫度為–6℃，濕度1.77g/m3，O2含量166g/m3，壓力54.1kPa，調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)高度以10m/s的速度勻速上升至海拔5000m水平，以模擬西北地區(qū)海拔5000m環(huán)境。該人工實(shí)驗(yàn)艙根據(jù)隨海拔升高，氣壓降低，空氣密度減小，空氣成分不變的物理原理，采用減壓裝置使密閉艙內(nèi)壓力降低，密度減小，從而模擬所需的高原低氧環(huán)境。

1.2.2 動(dòng)物模型氧合狀態(tài)評(píng)估 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)經(jīng)皮血氧飽和度(SpO2)及動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)。將空腹妊娠期綿羊臥位固定于解剖臺(tái)上，伸展后肢向外伸直，暴露腹股溝三角動(dòng)脈搏動(dòng)部位，剪毛，碘酒消毒。注射器抽取625U/m l肝素鈉0.2m l，轉(zhuǎn)動(dòng)注射器使其內(nèi)均勻附著肝素。左手手指觸及股動(dòng)脈跳動(dòng)處，穿刺動(dòng)脈取鮮紅血液2m l，用干藥棉壓迫止血2～3m in。拔針同時(shí)立即排空氣泡，將針頭迅速刺入橡皮塞，平穩(wěn)靜置送至檢驗(yàn)科于2h內(nèi)完成檢測(cè)。共檢測(cè)6次，時(shí)間點(diǎn)分別為進(jìn)艙建模前(0d)及進(jìn)艙建模后第7、15、30、90、120d。

1.2.3 動(dòng)物模型一般情況監(jiān)測(cè) 分別于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d連續(xù)觀測(cè)并記錄所有孕羊的體溫、呼吸、心率、血壓、飲食情況和行為運(yùn)動(dòng)情況。

1.2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)評(píng)價(jià) 分別于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d穿刺取妊娠期綿羊肝臟組織，所有取出組織(0.1～0.2g)以1:20的比例加入冰冷0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，用勻漿器在0～4℃下制成勻漿液，進(jìn)行蛋白質(zhì)氧化損傷的生物標(biāo)志物羰基(carbonyl groups，CO)、細(xì)胞氧化損傷的生物標(biāo)志物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的檢測(cè)，用于評(píng)價(jià)妊娠期綿羊缺氧模型體內(nèi)的氧化損傷程度。其中，CO檢測(cè)采用分光光度法[4]，MDA檢測(cè)采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)定量分析法，TBARS涵蓋了大部分氧化損傷導(dǎo)致的醛酮類物質(zhì)，是衡量脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)之一[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，兩組總體均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)各亞組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同海拔高度對(duì)妊娠期綿羊氧合狀態(tài)的影響觀察不同時(shí)間點(diǎn)妊娠期綿羊的SpO2(mm Hg)及SaO2(%)，結(jié)果顯示：在造模第0天和7天，3組動(dòng)物間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。從造模第15d開始直到造模第120天，MHE組及SHE組SpO2和SaO2水平明顯低于LAC組(P＜0.05)，且SHE組明顯低于MHE組(P＜0.05，表1)。按照30mmHg＜PaO2＜60mmHg且60%＜SaO2＜90%為輕度缺氧的診斷標(biāo)準(zhǔn)，造模30d時(shí)MHE動(dòng)物造模成功；按照PaO2＜30mm Hg且SaO2＜60%為重度缺氧的診斷標(biāo)準(zhǔn)，造模90d時(shí)SHE動(dòng)物造模成功。最終得出應(yīng)用人工實(shí)驗(yàn)艙模擬西北地區(qū)高原低氧氣候環(huán)境，建立輕度缺氧妊娠期綿羊模型的具體條件為溫度5℃，濕度3.68g/m3，空氣中O2含量206g/m3，壓力67.7kPa，高度以10m/s的速度勻速上升到海拔3000m水平，造模用時(shí)30d；建立重度缺氧妊娠期綿羊模型的具體條件為溫度–6℃，濕度1.77g/m3，空氣中O2含量166g/m3，壓

表1 3組妊娠期綿羊不同時(shí)間點(diǎn)SpO2(mmHg)及SaO2(%)結(jié)果對(duì)比(±s, n=8)Tab. 1 SpO2 (mmHg) and SaO2 (%) in pregnant sheep of 3 groups at different time points (±s, n=8)

LAC. Low altitude control group; MHE. M ild hypoxia exposure group; SHE. Severe hypoxia exposure group; (1)P＜0.05 compared with LAC;(2)P＜0.05 compared with MHE

Group 0d 7d 15d 30d 90d 120d SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 LAC 85±4 96±3 84±5 95±4 86±2 97±1 83±4 93±6 82±5 92±2 87±1 94±3 MHE 83±3 94±4 81±3 91±2 73±4(1) 83±5(1) 56±3(1) 72±2(1) 43±2(1) 67±4(1) 40±3(1) 70±2(1)SHE 86±2 95±3 79±5 90±1 44±3(1)(2) 70±6(1)(2) 29±2(1)(2) 55±1(1)(2) 24±1(1)(2) 42±3(1)(2) 22±4(1)(2)38±3(1)(2)

力54.1kPa，高度以10m/s勻速上升至海拔5000m水平，造模用時(shí)90d。

2.2 不同海拔高度對(duì)妊娠期綿羊生命體征及行為狀態(tài)的影響 建模前至建模后30d，各組妊娠期綿羊各項(xiàng)生命體征及一般情況變化不明顯；從建模后90d開始，MHE組及SHE組動(dòng)物的呼吸頻率較LAC組降低(P＜0.05)，心率較LAC組升高(P＜0.05)，運(yùn)動(dòng)減少，SHE組動(dòng)物的飲食較其他兩組減少；各組間妊娠期綿羊其余生命體征未發(fā)現(xiàn)明顯改變(表2)。

表2 建模后90d不同分組妊娠期綿羊生命體征及一般情況結(jié)果對(duì)比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

表2 建模后90d不同分組妊娠期綿羊生命體征及一般情況結(jié)果對(duì)比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

(1)P＜0.05 compared with LAC

Group Body temperature (℃) Breath (/m in) Heart rate (/m in)Systolic pressure (kPa) Diastolic pressure (kPa) Diet Movement LAC 37.7±0.5 18.0±2.0 70.0±4.0 15.9±0.7 9.3±0.9 Normal Normal MHE 36.3±0.4 14.0±2.0(1) 77.0±2.0(1) 17.3±0.5 10.5±0.4 Normal Reduced SHE 36.9±0.5 12.0±1.0(1) 78.0±3.0(1) 18.1±0.3 11.1±0.8 Reduced Reduced

2.3 不同海拔高度對(duì)妊娠期綿羊氧化應(yīng)激的影響

圖1 建模后120d不同分組妊娠期綿羊氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物結(jié)果對(duì)比Fig.1 Results of oxidative stress biomarkers in 3 groups of gestational sheep 120 days after modeling(1)P＜0.05 compared with LAC group; (2)P＜0.05 compared with MHE group

建模前至建模后90d，MHE組及SHE組妊娠期綿羊的CO和MDA水平與LAC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；從建模后120d開始，MHE組及SHE組妊娠期綿羊的CO和MDA水平均明顯高于LAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且SHE組CO、MDA水平明顯高于MHE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

3 討 論

醫(yī)學(xué)上將海拔高度為3000m以上的地區(qū)稱為高原。我國(guó)高原地域遼闊，占全國(guó)土地總面積的26%[6]。這些地區(qū)空氣稀薄，低溫低氧，這種高原低氧環(huán)境在系統(tǒng)水平、器官水平、細(xì)胞水平、分子水平甚至基因水平都可對(duì)人體功能產(chǎn)生多種負(fù)面影響。

高原低氧環(huán)境對(duì)妊娠期母體和胎兒都會(huì)產(chǎn)生巨大影響。嚴(yán)重的長(zhǎng)時(shí)間氧氣供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致胎兒腦組織發(fā)生不可逆的損傷[7]。缺氧可導(dǎo)致胎兒消化道黏膜損傷，引起新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎。缺氧引起的酸中毒會(huì)導(dǎo)致胎兒的心臟糖原耗竭，顯著降低其心臟的能量和氧氣供應(yīng)。缺氧可誘導(dǎo)胎兒體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)失衡[8]，炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，引發(fā)胎兒大腦和心臟組織重塑、心肌雙核化過程延遲[9]，這些都會(huì)導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)和發(fā)育的異常。

目前關(guān)于高原低氧環(huán)境對(duì)妊娠期母體及胎兒影響的研究還比較有限，一是因?yàn)楦咴h(huán)境惡劣，現(xiàn)場(chǎng)研究不便于實(shí)施，二是因?yàn)樯形唇⑤^為簡(jiǎn)便有效的動(dòng)物模型供研究使用?；诖耍狙芯客ㄟ^調(diào)整人工實(shí)驗(yàn)艙溫度、濕度、壓力和氧含量等指標(biāo)，最大化地模擬西北地區(qū)高原低氧環(huán)境，成功制備出不同程度的妊娠期綿羊缺氧動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示，在模擬西北高原低氧環(huán)境的人工實(shí)驗(yàn)艙中飼養(yǎng)90d后，妊娠期綿羊出現(xiàn)呼吸頻率減低、心率加快、運(yùn)動(dòng)及飲食減少的現(xiàn)象，且不同程度低氧環(huán)境暴露下，妊娠期綿羊的SpO2、SaO2水平，飲食情況及氧化損傷程度不同，表明缺氧環(huán)境造成了動(dòng)物生命體征和行為的改變，與之前的一些研究報(bào)道相符[1,10]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(react ive nit rogen species，RNS)是引起蛋白質(zhì)氧化損傷的重要因素[11-13]，可通過多種代謝途徑產(chǎn)生，易與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應(yīng)，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的廣泛病理?yè)p傷[3]。因此通過檢測(cè)由自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可評(píng)估體內(nèi)是否發(fā)生了氧化性損傷[14]。在模擬西北高原低氧環(huán)境的人工實(shí)驗(yàn)艙中飼養(yǎng)120d后，妊娠期綿羊肝組織內(nèi)氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物CO、MDA含量上升，表明高原低氧環(huán)境誘發(fā)了動(dòng)物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起妊娠期母體體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷。

本研究結(jié)果表明，在平原地區(qū)也可以通過對(duì)人工實(shí)驗(yàn)艙的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行精確控制，完成所需的高原特殊環(huán)境下動(dòng)物模型的制備，省錢省力，操作簡(jiǎn)單，便于推廣。我們?cè)谠炷＿^程中還觀察到在高原低氧環(huán)境下妊娠期綿羊多項(xiàng)指標(biāo)的改變，提示妊娠期缺氧對(duì)母體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生了較大影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們還將通過檢測(cè)胎兒蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的改變，繼續(xù)觀察高原低氧環(huán)境對(duì)不同妊娠期母體綿羊體內(nèi)胎兒心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)發(fā)育的具體影響，以期為妊娠期高原缺氧性疾病的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)研究提供理論依據(jù)。

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