李慧娟，何援利，胡海燕，李競雄，王顯，陳思萍，張冬梅

論 著

Interceed對宮腔粘連兔子宮內膜容受性的影響

李慧娟，何援利，胡海燕，李競雄，王顯，陳思萍，張冬梅

目的 探討氧化再生纖維素防粘連膜(Interceed)治療新西蘭大白兔宮腔粘連(IUA)的有效性及其對子宮內膜容受性的影響。方法 將48只雌兔隨機分為4組(每組12只)：正常對照組(A)、Interceed對照組(B)、模型未治療組(C)、Interceed治療組(D)。A組行假手術，不造模；B組：正常兔子宮內放置Interceed；C和D組均采用機械和感染雙重損傷法構建IUA動物模型，C組不進行治療，D組建模后7d宮腔內放置Interceed。各組于28d各處死4只動物，收集雙側子宮組織，行HE和Masson染色檢測子宮內膜腺體計數(shù)和纖維化面積。每組剩余的8只兔于動情期刺激陰道排卵，于假孕第7天處死，取子宮組織，掃描電鏡觀察子宮內膜胞飲突的表達，免疫組化檢測子宮內膜中整合素αVβ3蛋白水平。結果 與C組比較，D組子宮內膜腺體表達及纖維化程度均明顯改善(P<0.05)，但A、B、D組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義。A組子宮內膜表面有大量發(fā)育完全的胞飲突；B組胞飲突表達與A組相似；C組胞飲突分布稀少，發(fā)育不同步；D組胞飲突分布較C組增多，形態(tài)欠規(guī)則，發(fā)育同步。C組子宮內膜整合素αVβ3蛋白表達明顯低于A組(P<0.05)；D組整合素αVβ3蛋白表達較C組明顯增高(P<0.05)。結論 Interceed可一定程度逆轉IUA的病理改變，增加子宮內膜整合素αVβ3蛋白的表達，并改善胞飲突的表達和發(fā)育，從而改善子宮內膜的容受性。

宮腔粘連；氧化再生纖維素防粘連膜；胞飲突；整合素αVβ3

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)是指由于手術、刮宮、電灼和藥物腐蝕等原因致子宮內膜基底層損傷，引起子宮內膜瘢痕修復，從而導致宮腔肌壁和(或)宮頸管的全部或部分閉鎖[1]。宮腔鏡檢查及鏡下宮腔粘連分離術(transcervical resection of adhesions，TCRA)是目前診療的金標準[2]，針對TCRA術后粘連復發(fā)率高的問題，多數(shù)學者傾向于采取以屏障治療為主的綜合治療，如放置宮內節(jié)育器+雌激素、放置小兒球囊導尿管、宮腔注射透明質酸膠體、羊膜移植、干細胞治療等。也有學者應用防粘連材料，可在一定程度上改善患者的月經癥狀，但仍存在一定的局限性，妊娠率遠遠達不到令人滿意的程度[3]。本課題組前期已成功將Interceed包繞宮內節(jié)育器并聯(lián)合大劑量雌激素用于IUA分離術后，其防粘連效果顯著，但由于觀察時間短，大部分患者仍在治療中，其妊娠率未見明顯差異[4]。本研究以此為出發(fā)點，探討Interceed治療兔IUA的有效性及其對子宮內膜胞飲突和整合素αVβ3的影響，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 細菌脂多糖(LPS)為Sigma公司產品；Masson染色試劑盒購自凱基公司；烏拉坦購自美國Amresco公司；多聚甲醛購自武漢博士德公司；Interceed防粘連膜購自美國強生公司；整合素αVβ3多克隆抗體為BioLegend公司產品；生物顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品；S-3000N掃描電鏡為日本日立公司產品。

1.2 實驗動物分組及處理 健康成年雌性未孕普通級新西蘭大白兔48只，體重3000～4000g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供[實驗動物許可證號：SCXK(粵)2011-0015]。將48只兔隨機分為4 組(n=12)：正常對照組(A組)、Interceed對照組(B 組)、模型未治療組(C組)、Interceed治療組(D組)。A組：行假手術，不造模。B組：在正常兔子宮中下1/3處做0.5cm縱切口，用1號無菌手術線將長約5.0cm、寬1.0cm的Interceed引入宮腔。C組和D組均采用機械和感染雙重損傷法構建IUA動物模型，具體操作按照課題組前期研究方法[5]進行。C組：建模后不治療。D組：建模后7d開腹，于子宮原切口處行0.5cm縱切口，用1號無菌手術線將長約5.0cm、寬1.0cm的Interceed引入宮腔。28d后各組分別處死4只動物，觀察子宮形態(tài)變化，取雙側子宮組織，行HE染色觀察子宮內膜形態(tài)學變化并進行腺體計數(shù)，Masson染色檢測子宮內膜纖維化程度。各組各剩余8只兔，在其動情期用消毒過的涂有甘油的圓滑玻璃棒刺激陰道，誘發(fā)排卵，構建兔假孕模型，于假孕第7天處死，迅速剖腹取出子宮，掃描電鏡觀察胞飲突的表達，免疫組化法檢測子宮內膜中整合素αVβ3蛋白的水平。

1.3 子宮內膜腺體數(shù)量和纖維化程度檢測 各組28d后取子宮組織，經4%甲醛溶液固定24～48h后，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，行HE和Masson染色。每張HE染色切片選取5個高倍鏡視野，計數(shù)每個視野下腺體數(shù)量，取其平均值。Masson染色下子宮內膜間質膠原纖維染成藍色，呈梭形，排列整齊。每張Masson染色切片選取5個視野，用Imagepro Plus 6.0軟件分析每個視野子宮內膜間質纖維化的面積及子宮內膜間質和腺體總面積。纖維化面積百分比為每個視野子宮內膜間質纖維化的面積除以子宮內膜間質和腺體的總面積，取平均值。

1.4 胞飲突的觀察 各組假孕第7天處死，留取子宮組織，縱行剖開，固定于2.5%戊二醛溶液中，固定后的標本用PBS徹底沖洗，系列乙醇脫水，置于2%乙酸異戊酯中3h，臨界點干燥、樣本粘貼、涂銀膠、噴金，掃描電鏡觀察胞飲突的表達。根據(jù)Nikas等[6]的標準將胞飲突按發(fā)育程度分為發(fā)育中、完全發(fā)育及退化3類。發(fā)育中的胞飲突特征形態(tài)為光滑、薄弱的質膜突起，呈現(xiàn)在整個細胞頂端；發(fā)育完全的胞飲突呈現(xiàn)出“菜花樣”腫脹的質膜狀突起，一般認為其出現(xiàn)標志著子宮內膜的最佳容受期；退化的胞飲突開始出現(xiàn)皺褶、塌陷，部分逐漸被微絨毛取代。按分布情況分為豐富(>50%)、適中(20%～50%)和微量(<20%)3個層次。

1.5 整合素αVβ3的免疫組化染色 各組假孕第7天處死動物留取子宮組織，經4%甲醛溶液固定24～48h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，行免疫組化染色檢測子宮內膜中整合素αVβ3的表達。子宮內膜組織內呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號，每張切片在光鏡下隨機取5個高倍鏡視野，經Image Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)分析，測定陽性信號的平均光密度值(MOD)，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，進行方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用多重比較LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 子宮組織形態(tài)學觀察 A組子宮外觀呈粉紅色，內膜區(qū)呈灰白色，可見腺體開口，HE染色可見黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層，黏膜層為單層柱狀上皮細胞，黏膜下層為豐富的腺體、血管和少量排列整齊的成纖維細胞；B組放置Interceed 第28天子宮組織形態(tài)與A組相似，宮腔內未觀察到Interceed殘留，HE染色未觀察到明顯炎癥反應；C組可見子宮粗細不均且輕度積水，HE染色見單層柱狀上皮細胞消失，由扁平上皮細胞或低柱狀上皮細胞覆蓋，損傷嚴重區(qū)上皮缺失，黏膜下腺體極少，纖維化增生明顯，排列紊亂；D組Interceed治療后28d子宮解剖學結構基本恢復正常，HE染色下見柱狀上皮細胞再生，腺體不同程度增多(圖1、2)。

2.2 子宮內膜腺體數(shù)量比較 A、B、D組子宮內膜腺體數(shù)量兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均明顯高于C組(P<0.05，表1)。

圖1 各組新西蘭大白兔子宮大體觀察Fig.1 The uterus of New Zealand white rabbit in each group

圖2 各組兔子宮內膜HE染色結果(×400)Fig.2 HE staining of endometrium in each group (×400)

表1 各組子宮內膜腺體數(shù)量及纖維化面積比較(±s，n=8)Tab.1 Number of glands and the area of fibrosis in endometrium in each group (±s, n=8)

表1 各組子宮內膜腺體數(shù)量及纖維化面積比較(±s，n=8)Tab.1 Number of glands and the area of fibrosis in endometrium in each group (±s, n=8)

(1)P<0.05 compared with group C

?

2.3 子宮內膜纖維化面積比率的比較 Masson染色顯示，A組子宮內膜間質表達少量膠原纖維，染成藍色，呈梭形，排列整齊；B組膠原纖維的表達與A組相似，排列較整齊；C組間質層纖維組織增多，膠原聚集致密且排列紊亂；D組治療后膠原纖維明顯比C組減少，稀疏且排列整齊(圖3)。4組間子宮內膜纖維化面積百分比比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。A組、B組和D組子宮內膜纖維化面積百分比均明顯低于C組(P<0.05)，而A、B、D組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

2.4 子宮內膜胞飲突的表達 掃描電鏡觀察結果顯示，A組子宮內膜均勻分布大量膜狀突起，大小一致，邊界清楚，胞飲突表面因微絨毛的消失而變得光滑，呈蘑菇樣外觀，即完全發(fā)育的胞飲突；B組胞飲突豐富，大小不一致，邊界清楚，偶有短而細的微絨毛，為完全發(fā)育的胞飲突；C組胞飲突表達被抑制，分布明顯稀少，發(fā)育不同步，呈局灶性生長，部分為完全發(fā)育的胞飲突，部分為開始衰退的胞飲突；D組胞飲突較C組增多，形態(tài)欠規(guī)則，邊界清楚，大多為完全發(fā)育的胞飲突，極少數(shù)為開始衰退的胞飲突(圖4)。

圖3 各組兔子宮內膜Masson染色結果(×400)Fig.3 Masson staining of endometrium in each group (×400)

2.5 整合素αVβ3蛋白在子宮內膜中的表達 整合素αVβ3蛋白表達于子宮內膜腔上皮、腺上皮細胞的細胞膜及胞質中，呈棕黃色顆粒狀(圖5)。與A組(0.36±0.05)比較，B組子宮內膜整合素αVβ3蛋白的表達(0.33±0.04)無明顯變化，而C組和D組(分別為0.17±0.05、0.26±0.04)的表達則明顯降低(P<0.05)，且C組的表達明顯低于D組(P<0.05)。

圖4 各組兔子宮內膜胞飲突的表達(×2000)Fig.4 Expression of pinopodes in rabbit endometrium in each group (×2000)

圖5 整合素αVβ3蛋白在各組兔子宮內膜的表達(免疫組化 ×400)Fig.5 Expression of integrin αVβ3 in endometrium in each group (Immunohistochemistry ×400)

3 討 論

創(chuàng)傷和感染等可引起子宮內膜基底層破壞、間質裸露、成纖維細胞和結締組織增生，促進子宮內膜纖維化，從而形成IUA[7-8]，IUA可致月經量過少、閉經、繼發(fā)性不孕、周期性下腹痛及嚴重產科并發(fā)癥(如流產、早產、胎盤粘連、前置胎盤、胎盤植入和產后出血)[9]等。本研究采用機械和感染雙重損傷法構建的兔IUA模型中肉眼可見的宮腔粘連帶較少，但結果顯示建模后子宮內膜腺體數(shù)量減少，纖維化面積增加，與本課題組前期研究結果一致[5]，這些病理改變均符合IUA的臨床病理特征[10]，故該方法可以構建較為穩(wěn)定的新西蘭大白兔IUA模型，并可通過此模型評價Interceed治療兔IUA的有效性及其對子宮內膜容受性的影響。

Interceed是一種氧化再生纖維素防粘連膜，是經氧化氮處理的可吸收人造纖維織物，具有生物相容性好、可降解、無毒、安全有效等優(yōu)點，其用于盆腹腔術后防粘連效果十分明確，但用于預防IUA的研究較少。Gago等[11]通過一項體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)Interceed對間皮細胞和成纖維細胞的形態(tài)和生長情況無明顯影響，但能使間皮細胞組織型纖溶酶原激活物(tPA)mRNA的表達升高25%，而纖溶酶原激活物抑制物(PAI)mRNA的表達并未發(fā)生變化，因此tPA/PAI的比值升高，從而激活纖溶活性，薄弱的纖維蛋白粘連會被纖溶系統(tǒng)局部釋放的蛋白酶所降解。Bicer等[12]在一項兔心包防粘連的動物研究中也發(fā)現(xiàn)術后3周和6周Interceed組的纖維增生明顯少于對照組。本課題組前期研究未觀察Intrceed治療IUA后的病理變化，而且由于臨床治療周期長，隨訪時間短，尚未觀察到妊娠率存在差異[4]。本研究結果顯示，Interceed治療組(D組)子宮內膜腺體數(shù)量和纖維化程度與模型未治療組(C組)比較均明顯改善，Interceed對照組(B組)子宮內膜腺體數(shù)量和纖維化程度與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明Interceed對IUA有一定的治療作用，且無明顯不良反應?？紤]其機制可能為：①保護膜機制；②Interceed具有影響巨噬細胞功能從而改變炎癥反應狀態(tài)的作用[13]；③Interceed可通過激活纖溶活性而釋放蛋白酶，降解纖維粘連蛋白[11]。

IUA發(fā)生的根本原因是子宮內膜基底層損壞。韓燕華等[14]的研究結果提示IUA患者子宮內膜整合素αVβ3表達異常，可能降低子宮內膜容受性，影響囊胚著床，從而引發(fā)不孕或流產。胞飲突是在掃描電鏡下所見宮腔被覆上皮細胞膜頂端出現(xiàn)的光滑膜性足狀或蘑菇狀突出物，在嚙齒類動物、兔、牛等以及人的子宮內膜上都可見。胞飲突的作用主要是有利于囊胚定位附著，與囊胚著床的啟動有關。完全發(fā)育的胞飲突是子宮內膜容受性建立和植入窗開放的重要形態(tài)學標志[15]。整合素αVβ3在胚胎植入過程中介導胚胎滋養(yǎng)層細胞與子宮內膜上皮細胞之間的相互作用，被公認為是子宮內膜容受性的標記分子之一[16]。在植入窗期，整合素αVβ3與胞飲突同步出現(xiàn)。本研究結果顯示，Interceed對照組(B組)子宮內膜胞飲突及整合素αVβ3蛋白表達與正常對照組(A組)相似。模型未治療組(C組)子宮內膜胞飲突分布明顯稀少，呈局灶性生長，發(fā)育不同步，整合素αVβ3蛋白表達明顯低于正常對照組。Interceed治療組(D組)胞飲突及整合素αVβ3蛋白表達較模型未治療組(C組)明顯改善，但胞飲突表達仍不同步且形態(tài)欠規(guī)則，整合素αVβ3蛋白表達也低于正常對照組。說明Interceed治療IUA后子宮內膜容受性有所改善，但仍達不到正常水平。

相關研究表明，Interceed在有血液和腹膜液存在時，其有效性受到一定限制[17]。因此，本研究在實驗過程中特別注意到了以下兩點：①將Interceed置入兔宮腔時應注意與子宮腔要有相對活動度，以免在置入過程中過緊引起宮腔內出血或子宮水腫而影響Interceed的有效性，但又不宜太松，即做到輕拉時能移動，不拉時不移動，保證足夠量的Interceed存在于宮腔內；②Interceed使用后如果變黑應棄用，充分止血后置入新的Interceed，必要時用生理鹽水沖洗宮腔。

綜上所述，本研究結果表明，Interceed可一定程度逆轉IUA兔子宮內膜的病理變化。采用機械和感染雙重損傷法構建的兔IUA模型的子宮內膜容受性明顯降低，Interceed可在一定程度上改善子宮內膜整合素αVβ3蛋白的表達和胞飲突的發(fā)育，從而提高IUA兔子宮內膜的容受性。若在治療的同時加用一些提高子宮內膜容受性的藥物可能會達到更好的效果。不是之處在于本研究只觀察了Interceed治療IUA的有效性及其對IUA子宮內膜容受性的影響，未進行雌雄交配觀察其妊娠結局，其對妊娠結局的影響尚有待進一步研究。

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Effects of Interceed on endometrial receptivity in rabbits with intrauterine adhesion

LI Hui-juan, HE Yuan-li*, HU Hai-yan, LI Jing-xiong, WANG Xian, CHEN Si-ping, ZHANG Dong-mei
Department of Obstetrics and Gynecology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China
*

, E-mail: heyuanli310@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270658)

ObjectiveTo observe the effect of anti-adhesion membrane made of oxidized regenerated cellulose (Interceed) on endometrial receptivity in New Zealand white rabbits with intrauterine adhesion (IUA).MethodsForty-eight female rabbits were randomly divided into 4 groups (12 each): normal control group (group A), Interceed control group (group B), untreated model group (group C), and Interceed therapy group (group D). Rabbits in group A

sham operation and underwent no modeling. The Interceed was placed into the normal rabbits' uteruses in group B. The IUA rabbit models were reproduced in group C and group D by both mechanical injury and infection. Rabbits in group C were not treated, and in group D Interceed was put into their uteruses 7 days after modeling. Four rabbits in each group were sacrificed on the 28th day, the uterine tissues were collected. The endometrial glands count was performed after HE staining, and the degree of endometrial fibrosis was assessed after Masson staining. For the remaining animals in each group, ovulation was induced by stimulating the vagina in estrus, and they were sacrificed and the uterine tissue was collected on the 7th day after pseudopregnancy. The expression of pinopodes in endometrium was observed by scanning electron microscopy, and that of integrin αvβ3 protein was determined by immunohistochemistry.ResultsThe expression of glands and the degree of fibrosis in endometrium was obviously improved in group D as compared with that of group C (P<0.05), but no significant difference was found among the groups A, B and D. In group A, and developed pinopodes were abundantly expressed in endometrial surface, and similar changes were found in group B. The expression of pinopodes in group C was scarce, and the development was not synchronized. More pinopodes, with irregular shape and synchronized development, were expressed in group D than in group C. The expression of integrin αvβ3 protein was significantly lower in group C than in group A and group D (P<0.05).ConclusionInterceed may alleviate the endometrial pathological changes, increase the expression of integrin αVβ3 protein, ameliorate the expression and development of pinopodes, thus improve the endometrial receptivity.

intrauterine adhesions; interceed; pinopodes; integrin alphaVbeta3

R711.32

A

0577-7402(2015)05-0344-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.02

2014-12-05；

2015-01-29)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學基金(81270658)

李慧娟，碩士研究生。主要從事女性不孕癥及宮腔粘連的基礎與臨床研究

510282 廣州 南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科(李慧娟、何援利、胡海燕、李競雄、王顯、陳思萍、張冬梅)

何援利，E-mail：heyuanli310@163.com