韓志海，張燕，段蘊(yùn)鈾，姜毅，王曉陽(yáng)，方庭正，黃燕

·短篇報(bào)道·

H2S對(duì)煙霧吸入肺損傷大鼠的抗氧化作用研究

韓志海，張燕，段蘊(yùn)鈾，姜毅，王曉陽(yáng)，方庭正，黃燕

煙霧吸入損傷；氧化性應(yīng)激；硫化氫

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠24只，體重150～250g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)-2012-0004]提供，海軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(軍)-2012-0012]飼養(yǎng)。按照隨機(jī)化原則將動(dòng)物分為對(duì)照組、煙霧組、煙霧+H2S 3h組、煙霧+H2S 6h組，每組6只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 按照本課題組已成功建立的方法進(jìn)行大鼠煙霧吸入性肺損傷模型制作，煙霧組、煙霧+H2S 3h組、煙霧+H2S 6h組各取2只大鼠分別置入吸煙瓶中，至出現(xiàn)呼吸深慢、張口喘鳴時(shí)或滿2min時(shí)限時(shí)，停止煙霧吸入，立即敞開(kāi)吸煙瓶口，使其吸入空氣7min。重復(fù)上述步驟3～5次，至大鼠吸入空氣7min仍舊昏迷不醒時(shí)結(jié)束。

在煙霧吸入后，煙霧+H2S 6h組大鼠予以6h持續(xù)吸入H2S 80mg/L+30%O2，煙霧+H2S 3h組大鼠予以3h持續(xù)吸入H2S 80mg/L+30%O2，對(duì)照組、煙霧組予以吸入30% O26h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠予以安樂(lè)死，分離肺葉，右肺上、下葉分別置液氮凍存，右肺中葉4%多聚甲醛溶液浸泡72h后常規(guī)石蠟包埋。

1.3 ELISA檢測(cè) 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)右肺下葉勻漿中谷胱甘肽(GSH)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)濃度，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作。

1.4 免疫組化法檢測(cè)右肺中葉肺組織NF-κBp65、Nrf2(nuclear factor-E2 related factor)含量 右肺中葉肺組織石蠟切片厚度3μm，60～65℃烤片4h，脫蠟，水化，PBS洗滌，高壓修復(fù)組織抗原，3%H2O2滅活過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉，分別滴加第一抗體anti-NF-κBp65 antibody (Abcam，ab16502)、Anti-Nrf2 antibody (Abcam，ab31163)各50μl，稀釋至1:200，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，滴加復(fù)合二抗HRP-Polymer anti Mouse/Rabbit IgG(Maixin.Bio，KIT-5020)，室溫靜置20min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照以血清代替一抗。鏡檢黃色或棕黃色染色判為陽(yáng)性。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)進(jìn)行半定量分析，IPP6.0軟件分析得出每個(gè)視野陽(yáng)性染色的平均光密度(mean density)、積分光密度(integrated optical density，IOD)的總和即累積光密度(sum IOD)，計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本上述指標(biāo)的均值，從而對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.5 肺組織γ-GCS mRNA的定量檢測(cè) 采用熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠右肺上葉γ-GCS mRNA。引物由嘉美生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，上游5'-GCATTC ATTTCACCCTGTTCT-3'，下游5'-ACAAAGAGCCC TGACCTAATG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度132bp。用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本總RNA。用HiFi-MMLVc DNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用Ultra SYBR Mixture(with Rox)(CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0956)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，40個(gè)循環(huán)。采用2–ΔΔCt法計(jì)算產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織勻漿檢測(cè)結(jié)果 煙霧組大鼠肺組織勻漿中GSH濃度較對(duì)照組明顯降低(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組GSH濃度較煙霧組明顯降低(P<0.001)。煙霧組大鼠γ-GCS濃度較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組γ-GCS濃度與煙霧組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。煙霧組γ-GCS mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組γ-GCS mRNA的相對(duì)表達(dá)量較煙霧組明顯降低(P<0.001，表1)。

2.2 大鼠肺組織Nrf2及NF-κBp65的免疫組化檢測(cè)及半定量分析結(jié)果 煙霧組大鼠肺組織Nrf2平均光密度與累積光密度較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組較煙霧組明顯降低(P<0.05)。煙霧組大鼠肺組織NF-κBp65的累積光密度較對(duì)照組明顯增高(P<0.001)，煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組較煙霧組明顯降低(P<0.05)，煙霧+H2S 3h組與煙霧+H2S 6h組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1 大鼠肺組織勻漿GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

表1 大鼠肺組織勻漿GSH、γ-GCS、γ-GCS mRNA含(±s，n=6)Tab. 1 Concentration of GSH, γ-GCS, γ-GCS mRNA in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.01 compare with smoking group; (2)P<0.01 compare with control group

表2 大鼠肺組織NF-κBp65、Nrf2免疫組化檢測(cè)及半定量結(jié)果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

表2 大鼠肺組織NF-κBp65、Nrf2免疫組化檢測(cè)及半定量結(jié)果(±s，n=6)Tab. 2 Immunohistochemically detected the relative expression of NF-κBp65 and Nrf2 in rat lung tissue (±s, n=6)

(1)P<0.05 compare with smoking group; (2)P<0.05 compare with control group

3 討 論

本研究中煙霧組Nrf2及γ-GCS mRNA的表達(dá)、γ-GCS濃度均較對(duì)照組明顯增高，提示煙霧吸入后抗氧化應(yīng)激體系激活，以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷；煙霧+H2S 3h組及煙霧+H2S 6h組Nrf2、γ-GCS mRNA的表達(dá)較煙霧組降低，但γ-GCS的濃度與煙霧組比較無(wú)明顯變化，GSH濃度較對(duì)照組明顯降低，提示吸入H2S可抑制機(jī)體自身的抗氧化體系，推測(cè)原因?yàn)镠2S作為強(qiáng)還原性物質(zhì)，經(jīng)氣道吸入后可與氧化劑發(fā)生中和反應(yīng)，直接參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制機(jī)體自身的抗氧化體系[1]。H2S至少能與超氧陰離子、過(guò)氧化氫、超氧化氮及次氯酸四種氧自由基發(fā)生反應(yīng)[2-3]，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)免受自由基的損傷。H2S通過(guò)蛋白質(zhì)巰基化機(jī)制，抑制機(jī)體抗氧化體系的過(guò)度激活，從而減少能量消耗，為機(jī)體度過(guò)急性損傷期保存能量。

[1]Liu YF, Tang HW, Wu XL, et al. Reproduction and evaluation of a rat model of inhalation lung injury caused by black gunpowder smog[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(8): 670-674. [劉一凡, 唐紅衛(wèi), 吳小利, 等. 黑火藥煙霧致吸入性肺損傷大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(8): 670-674.]

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R563.9

A

0577-7402(2015)05-0425-02

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.20

2015-03-27；

2015-04-15)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

全軍“十二五”醫(yī)學(xué)科研課題(CWS11J180)

100048 北京 海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科(韓志海、張燕、段蘊(yùn)鈾、王曉陽(yáng)、方庭正、黃燕)；110032 沈陽(yáng) 沈陽(yáng)軍區(qū)政治部門診部(姜毅)

張燕，E-mail: changyan511@sohu.com