朱穎 孫蘊偉 章永平 袁耀宗 別里克

·論著·

抗氧化劑對慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化的影響

朱穎 孫蘊偉 章永平 袁耀宗 別里克

目的觀察外源性給予四氫吡咯二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)等氧化劑對慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺纖維化的影響，并探討其機制。方法 按完全隨機法將大鼠分為對照組、CP組、PDTC治療組、維生素E(Vit E)治療組、維生素C(Vit C)治療組。采用腹腔內注射二乙基二硫代氨基甲酸鹽(DETC) 750 mg/kg體質量、每周2次的方法制備CP模型。對照組不做任何處理。各治療組在注射DETC后30 min腹腔內分別注射PDTC 100 mg/kg體質量、Vit E 15 mg/kg體質量、Vit C 15 mg/kg體質量。注射DETC后90 min，24、48、72 h，2、3、4、6周時分批處死大鼠。取胰腺組織行常規(guī)病理檢查，采用分光光度比值法檢測胰腺組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(GSH-PX)和谷胱甘肽過氧化物酶(MDA)活性，免疫組化法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α -SMA)、結蛋白(Desmin)、膠原Ⅰ及Ⅲ、TGF-β1、纖維連接蛋白(FN)蛋白表達，RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA、FN mRNA表達。結果 各治療組6周時胰腺纖維化指標和腺體破壞指標都明顯低于CP組(P值均<0.01)，VitC組和VitE組空泡樣變指數(shù)也小于CP組(P值均<0.01)。2周起PDTC組、Vit C組和Vit E組胰腺的SOD、GSH-PX活性均較同時間點CP組升高，而MDA含量較同時間點CP組下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或<0.01)，各治療組間的差異無統(tǒng)計學意義。2周后各治療組TGF-β1、FN mRNA水平均較CP組下降(P<0.05或<0.01)，但仍高于對照組(P值均<0.05)，各治療組間的差異無統(tǒng)計學意義。結論 PDTC等抗氧化劑通過增強SOD等活性減少氧自由基產(chǎn)生，抑制PSCs的活化，并通過降低TGF-β1分泌，減少膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN的產(chǎn)生，抑制胰腺的纖維化。

胰腺炎，慢性； 纖維化； PDTC； 抗氧化劑； 胰腺星形細胞

在慢性胰腺炎(CP)的發(fā)生和發(fā)展過程中，氧化應激不作為單一致病因素，但氧自由基增多導致的胰腺腺泡損傷是CP的重要發(fā)病原因[1]。CP患者尤其是多次急性發(fā)作者的血清氧自由基濃度明顯增高，胰腺組織中亦有氧自由基的積聚，并伴有不同程度抗氧化物質的減少?？寡趸瘎┲委熞驯蛔C明能有效地減輕繼發(fā)于CP的腹痛[2-3]，并通過抑制胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)的活化來抑制胰島的纖維化[4]。本課題組曾采用大鼠腹腔內注射超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鹽(diethyldithiocarbamate，DETC)的方法建立CP模型[5]。本研究應用四氫吡咯二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine derivative of dithiocarbamate，PDTC)等抗氧化劑干預CP大鼠， 觀察其對CP大鼠PSCs活化及胰腺組織纖維化的影響，探討其作用機制。

材料與方法

一、動物模型建立及分組

雄性Wistar大鼠165只，體質量220～250 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。通過完全隨機法分為對照組、CP組、PDTC治療組、維生素C(Vit C)治療組、Vit E治療組。對照組5只大鼠不做任何處理，其余4組均采用腹腔內注射DETC 750 mg/kg體質量、每周2次的方法制備CP模型[5]，每組40只大鼠。各治療組大鼠在注射DETC后30 min分別注射PDTC 100 mg/kg體質量、Vit E 15 mg/kg體質量、Vit C 15mg/kg體質量。初次注射DETC后90 min，24、48、72 h，2、3、4、6周分批處死大鼠，取胰腺組織，部分液氮保存，部分4%甲醛固定。

二、胰腺組織病理學檢查

取固定胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，由病理科醫(yī)師閱片，并參考Su等[6]的標準進行CP病理評分。

三、胰腺組織SOD、GSH-PX活性及MDA含量測定

取液氮冷凍的大鼠胰腺組織，剪取50 mg，應用組織勻漿液制備勻漿，4 000 g離心15 min，取上清液。應用蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)定量蛋白濃度。應用SOD、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)測定SOD、GSH-PX活性和MDA含量，按試劑盒說明書操作。

四、胰腺組織α -SMA、Desmin、FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGF-β1蛋白表達檢測

采用免疫組化方法檢測胰腺組織α-平滑肌肌動蛋白( α-SMA)、結蛋白(Desmin)、纖維連接蛋白(FN)、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達?？功?SMA、Desmin免疫組化檢測盒和抗膠原Ⅰ、Ⅲ單抗購自美國Sigma公司；抗FN單抗和抗TGF-β1抗體購自福建邁新科技有限公司；羊抗兔IgG購自Santa Cruz生物科技有限公司。按試劑盒說明書操作，最后DAB顯色，蘇木素復染，透明、封片，光鏡下閱片。每切片取5個視野，計算陽性細胞百分比，0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按染色強度，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩分值相乘，0分為陰性(-)、1～4分弱陽性(+)、5～8分陽性(++)、9～12分強陽性(+++)。

五、胰腺組織TGF-β1、FN mRNA檢測

取液氮冰凍的胰腺組織，融化后采用Trizol(Gibcol公司)提取組織總RNA。先逆轉錄成cDNA，再行PCR擴增。TGF-β1正義序列5′-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3′，反義序列5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3′，擴增產(chǎn)物298 bp，F(xiàn)N正義序列：5′-ACATTGATCGCCCTAAAGGA-3′，反義序列：5′-CTGTGGACTGGGTTCCAAT-3′，擴增產(chǎn)物270 bp，以β-actin為內參。引物由上海博亞生物技術有限公司合成。常規(guī)PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外照相儀攝片，圖像分析軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達量。

六、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胰腺組織病理改變

對照組大鼠胰腺組織均正常。CP組大鼠1 d時見胰腺組織內有出血、炎性細胞浸潤、空泡樣變；2周時出現(xiàn)胰腺導管增生，間質內纖維組織增生，偶見細胞脂肪變性，無明顯腺體破壞；3周時胰周和小葉間見較明顯纖維組織，腺泡細胞之間也出現(xiàn)纖細的纖維組織；4周時部分腺體萎縮，脂肪浸潤，被部分纖維組織替代；6周時胰腺組織間隔明顯增寬，大量纖維組織增生，腺體萎縮被纖維組織或脂肪包繞、替代。各治療組大鼠的胰腺水腫和導管增生明顯，炎性細胞浸潤較CP組減輕，脂肪浸潤少見，組織間隙增寬，但以水腫為主，間隙內未見到明顯的纖維組織，胰周、小葉間和小葉內無明顯纖維組織增生，偶見細胞脂肪變性，無明顯的腺泡破壞，直到6周也未見明顯的纖維化和腺泡萎縮、破壞(圖1)。

CP組6周時胰腺的空泡樣變、葉間纖維化、葉內纖維化、脂肪浸潤及纖維化指標、腺體破壞指標的評分均顯著高于對照組。各治療組6周時胰腺的葉間纖維化、葉內纖維化、脂肪浸潤、纖維化指標、腺體破壞的評分均顯著低于CP組，VitC組和VitE組胰腺的空泡樣評分也顯著低于CP組(P值均<0.01，圖2)。

二、各組大鼠胰腺組織SOD、GSH-PX活性和MDA含量變化

對照組大鼠SOD、GSH-PX活性及MDA含量分別為(6.21±0.48)、(5.62±0.63) NU/mg、(0.20±0.04)nmol/mg。CP組各時間點大鼠胰腺組織SOD、GSH-PX活性均較對照組顯著下降，MDA含量均較對照組顯著升高(P值均<0.05) 。各治療組大鼠在72 h內胰腺組織SOD、GSH-PX活性均較對照組顯著下降，而顯著高于同時間點CP組大鼠，但MDA含量顯著高于對照組，而顯著低于CP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或<0.01)；2周后SOD、GSH-PX活性較同時間點CP組大鼠顯著升高，而MDA含量較同時間點CP組大鼠顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或<0.01)。但各治療組間的差異均無統(tǒng)計學意義(表2、3、4)。

圖1 CP組(1A)、PDTC組(1B)、Vit C組(1C )、Vit E組(1D)大鼠6周時的胰腺病理改變(HE ×400)

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與CP組比較，cP<0.05，dP<0.01圖2 對照組、CP組及各治療組6周時的胰腺病理評分

SOD與GSH-PX活性呈正相關(r=0.538，P<0.01)，SOD、GSH-PX活性與MDA含量均呈負相關(r值分別為-0.528、-0.502，P值均<0.01)。

SOD、GSH-PX活性與胰腺纖維化、胰腺破壞評分均呈顯著負相關(r值分別為-0.531、-0.497、-0.418、-0.560，P值均<0.01)，而MDA含量與胰腺纖維化、胰腺破壞評分均呈顯著相關(r值分別為0.545、0.493，P值均<0.01)。

表2 各組大鼠胰腺組織SOD活性變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

表3 各組大鼠胰腺組織GSH-PX活性變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

表4 各組大鼠胰腺組織MDA含量變化

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

三、胰腺組織α-SMA、Desmin、TGF-β1、膠原Ⅰ 、膠原Ⅲ、FN蛋白表達

α-SMA和Desmin蛋白表達于小葉間質、血管周邊和腺泡旁；TGF-β1表達于小葉間質的結締組織內，腺泡間也有少量表達；膠原Ⅰ、膠原Ⅲ表達在腺泡之間，呈網(wǎng)格狀包繞腺泡；FN主要表達在葉間纖維組織內，呈樹枝狀分布。

CP組大鼠胰腺組織自2周起α-SMA、Desmin、TGF-β1陽性表達，4、6周時無明顯增強；FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ在2周時弱陽性表達，至4周時呈強陽性表達。各治療組大鼠胰腺組織α-SMA、Desmin、TGF-β1也陽性表達，但較CP組減弱，呈弱陽性(圖3、4)；FN、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ少量弱陽性表達，未形成樹枝狀或網(wǎng)格狀結構(圖5)。

圖3 6周時CP組(3A)與PDTC組(3B)大鼠胰腺內α-SMA的表達(免疫組化 ×100)

圖4 6周時CP組(4A)與PDTC組(4B)大鼠胰腺內TGF-β1的表達(免疫組化 ×100)

圖5 6周時CP組(5A)與PDTC組(5B)大鼠胰腺內膠原I的表達(免疫組化 ×100)

四、胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達

對照組大鼠胰腺組織TGF-β1 、FN mRNA表達量分別為0.4562、0.4147；CP組大鼠胰腺組織TGF-β1 、FN mRNA表達量均較對照組顯著增加，各治療組大鼠胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達量較CP組顯著下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而各治療組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 各組大鼠胰腺組織TGF-β1、FN mRNA表達量

注：與CP組比較，aP<0.05，bP<0.01

討 論

文獻報道，氧自由基增多導致的胰腺腺泡損傷是CP的重要發(fā)病機制[1]。Dhingra等[3]報道，急慢性胰腺炎患者血清SOD等抗氧化酶減少，應用抗氧化劑治療可緩解患者的疼痛，并減少CP急性復發(fā)。Ryu等[4]報道，抗氧化劑通過抑制胰腺星狀細胞(PSCs)的活化而抑制胰島的纖維化。Lee等[7]報道，抗氧化劑可以通過減少胰島的纖維化，保護胰腺β細胞。高濃度的Vit C是自由基清除劑，還能使氧化的Vit E還原，兩者有協(xié)同作用。另有報道證實Vit E的水解產(chǎn)物α生育酚有治療CP的作用[8-9]， PDTC作為一種抗氧化劑，可通過抑制NF-κB的活性減輕重癥急性胰腺炎的臟器損傷[10]，但對于CP的治療作用尚無報道。

MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度，并間接反映細胞受損程度，而SOD和GSH-PX是機體清除自由基的重要酶類，SOD和GSH-PX的活性強弱往往提示體內抗氧化作用的強弱。本研究結果顯示，腹膜內注入氧化劑DETC后，各時間點胰腺組織的SOD和GSH-PX活性均低于正常對照組，而MDA含量增高，前兩者與后者呈負相關，提示DETC通過抑制SOD和GSH-PX活性使機體清除氧自由基的能力下降，造成氧自由基過剩，產(chǎn)生脂質過氧化反應，生成大量MDA，這種作用在72 h內尤為明顯。2周后CP組SOD、GSG-PX活性雖有所回升，但仍低于正常對照組，提示大鼠胰腺內自身的抗氧化機制有所激活，但仍低于正常水平。3周后CP組大鼠胰腺出現(xiàn)明顯纖維化，并伴有脂肪浸潤，腺體破壞等改變，可見長期慢性氧化刺激可能為CP發(fā)病機制中的重要因素。而用3種抗氧化劑治療后，治療組各時間點胰腺的SOD、GSH-PX活性均高于CP組；MDA含量較CP組減少，提示PDTC、Vit C和Vit E均可通過清除自由基降低脂質過氧化產(chǎn)物有效地對抗了DETC對SOD、GSH-PX活性的抑制作用，增強了清除自由基的能力，保護胰腺細胞。3周后治療組大鼠胰腺空泡樣變和脂肪變性較CP組明顯減少，與正常對照組大鼠相比，治療組大鼠胰腺水腫明顯，但增寬的組織間隙內并未見到明顯的纖維組織，小葉內的纖維化和腺體的萎縮破壞更是少見，相關性分析也證實了MDA含量與胰腺的纖維化和破壞程度顯著相關，而SOD和GSH-PX活性與之呈顯著負相關，表明抗氧化劑通過減少體內的氧自由基，避免其對胰腺的腺泡細胞長期攻擊而造成細胞變性壞死以及對炎性細胞的趨化作用，減輕胰腺的損害，抑制纖維組織的增生。這也再一次證實氧化應激在CP發(fā)病中的作用，抗氧化治療是抗胰腺纖維化的重要機制。受樣本量限制，不管是SOD、GSH-PX活性和MDA含量還是胰腺纖維化程度，3種不同藥物治療組之間的差異無統(tǒng)計學意義。

Desmin和α-SMA是PSCs活化的標志?；罨腜SCs促使TGF-β1分泌，TGF-β1反過來又促進PSCs的活化。PSCs分泌的膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和FN等膠原成分增多，它們沉積在腺泡周圍及間質中，最后在小葉間甚至小葉內形成大量纖維組織，這是CP的病理基礎。本研究結果顯示，治療組胰腺組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN、α-SMA、Desmin、TGF-β1在組織內表達均較CP組下調，以膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、FN尤為明顯。CP組大鼠α-SMA和Desmin主要表達在腺體間質、腺泡旁以及血管周邊，治療組α-SMA主要在血管周圍表達，標記正常的平滑肌細胞，而腺泡間僅有少量α-SMA和Desmin表達，提示PSCs的增生和活化被抑制。TGF-β1可由PSCs分泌，一定程度上反映了PSCs的活化與纖維化程度相關。本研究的治療組TGF-β1分泌量較CP組減少，提示抗氧化劑可抑制TGF-β1的分泌。膠原Ⅰ和膠原Ⅲ是膠原的主要成分，在CP組大鼠胰腺腺泡之間表達，構成網(wǎng)格狀包繞腺泡結構，治療組膠原Ⅰ、Ⅲ在腺泡之間少量表達，不構成網(wǎng)格狀，可能跟PSCs活化被抑制及TGF-β1分泌減少有關。

綜上所述，PDTC等3種抗氧化劑通過清除多余的氧自由基保護胰腺腺泡細胞，抑制PSCs增殖，導致TGF-β1的分泌減少，膠原Ⅰ、Ⅲ及FN等膠原成分分泌減少，明顯減輕大鼠胰腺纖維化和腺體萎縮的程度。但3種抗氧化劑的療效并無統(tǒng)計學差異。PDTC作為一種新的抗氧化劑，由于可抑制NF-κB活性，其對CP治療的作用機制有待進一步探索。

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(本文編輯：屠振興)

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Effect of antioxidants on pancreatic fibrosis of rats with chronic pancreatitis

Zhuying,Sunyunwei,ZhangYongping,YuanYaozong,BieLike.DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Correspondingauthor:BieLike,Email:BK_ERCP@163.com

Objective To investigate the effect of antioxidants including PDTC on pancreatic fibrosis of rats with chronic pancreatitis. Methods The rats were randomly divided into 5 groups including control group, CP group, PDTC treatment group, vitamin E treatment group and vitamin C treatment group. The CP model was in ducad by using intraperitoneal injection of DETC (750 mg/kg), twice a week. The control group received no treatment. After DETC injection, the treatment groups received an intraperitoneal injection of PDTC (100 mg/kg), vitamin E (15 mg/kg), vitamin C (15 mg/kg), respectively. Rats were sacrificed at 90 min, 24 h, 48 h, 72 h, 2 w, 3 w, 4 w, 6 w after first injection of DETC. Pancreatic tissue was taken for routine pathological examination. The activity of SOD, GSH-PX and MDA content were detected by spectrophotometric ratio method. α-SMA, desmin collagen Ⅰ, Ⅲ, TGF-β1, FN were detected by immunohistochemical assay. The expression of TGF-β1, FN mRNA was measured by RT-PCR. Results At 6w, the fibrosis and the parameters for damage of the pancreas in the three treatment groups were significantly better than that in CP group (P<0.01), the vacuolar degeneration index in vitamin E group and vitamin C group was also better than that in CP group (P<0.01). From the 2nd week, the activity of SOD, GSH PX in PDTC group, Vit C group and Vit E group was higher than that in CP group, while the MDA activity was lower than that in CP group, and the difference was statistically significant (P<0.01 orP<0.05). No significant difference was found among the three treatment groups. The mRNA levels of TGF-β1 and FN of the treatment groups were lower than those of CP group (P<0.05 orP<0.01), but higher than those of the control group (P<0.05). There was no significant difference among the three treatment groups (P>0.05). Conclusions PDTC and the other antioxidants can reduce oxygen free radicals by increasing the activity of SOD, suppressing the activation of PSCs, reducing the secretion of TGF-β1, Collagen Ⅰ, Ⅲ, FN and eventually inhibit the progress of pancreatic fibrosis.

Pancreatitis, chronic ; Fibrosis; PDTC; Antioxidants; Pancreatic stellate cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.008

200025 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院消化內科

別里克，Email: BK_ERCP@163.com

2015-03-17)