王振偉，許 鐳

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475004）

超聲波輔助提取刺梨中SOD的工藝研究

王振偉，許 鐳

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475004）

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，研究超聲波輔助提取刺梨中超氧化物歧化酶的工藝。結(jié)果表明：磷酸鈉緩沖溶液是SOD的有效提取劑，刺梨SOD的最合適pH值范圍為7.6～8.0。超聲提取最佳工藝條件為：超聲功率200W，固液比1∶10，超聲時(shí)間6 s，時(shí)間間隔2 s，超聲次數(shù)30次。按照該工藝提取刺梨SOD活性為546.9U／g。

超聲波；刺梨；超氧化物歧化酶；提取條件；工藝研究

0 引言

刺梨是薔薇科薔薇屬落葉灌木，又名繅絲花、文先果、送春歸，多分布于貴州、云南等西南省份［1］，近些年在河南也栽植成功。刺梨中含有特別高的超氧化物歧化酶（SOD），還含有豐富的維生素及微量元素。其中，SOD是國(guó)際公認(rèn)的具有抗衰老、防癌作用的活性物質(zhì)［2-4］。

隨著SOD藥理作用研究的深入，其提取也越來越受到人們的重視。目前，常用的提取方法有浸提法、索氏提取法、雙水相體系提取法、乙醇-氯仿法及超聲波輔助提取法［5-6］等。其中，用超聲波破碎細(xì)胞提取植物中的活性物質(zhì)費(fèi)時(shí)少、得率高，因此被廣泛應(yīng)用［7］。本研究以冷凍的刺梨果實(shí)為原料，采用超聲波破碎細(xì)胞法提取SOD，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件，為實(shí)現(xiàn)刺梨產(chǎn)品從低端到高附加值產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)施和方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用刺梨購(gòu)自河南開封金維康野生植物開發(fā)有限公司，所用試劑包括：鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸、鹽酸、乙醇（95%）、丙酮等。所有試劑均為分析純，水為蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)），JY99-IIDN型超聲波細(xì)胞破碎儀 （寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn)），HC-3018R型冷凍離心機(jī) （科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)），AB204-L型電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SOD的提取及活力測(cè)定

稱量10.0 g刺梨冷凍樣品，用榨汁機(jī)破碎打漿，加入一定體積的提取劑，振蕩混勻后，超聲波作用一定時(shí)間，然后，用高速冷凍離心機(jī)于6 000 r／min離心5min，收集上清液即為SOD粗提液。采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性［8］。

1.2.2 不同提取試劑提取效果比較

新鮮刺梨樣品破碎打漿后，按照固液比（刺梨質(zhì)量／磷酸緩沖液體積）1∶10分別加入蒸餾水（pH值為7.0）、0.05mol／L的磷酸鉀緩沖液 （pH值為7.8）、0.05 mol／L的磷酸鈉緩沖液（pH值為7.8）和0.05mol／L的氯化鈉溶液，超聲波功率300W，超聲提取5min，用高速冷凍離心機(jī)于6 000 r／min離心5min，收集上清液，并測(cè)定其活性。

1.2.3 超聲波提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過初步的實(shí)驗(yàn)探索，選取固液比、超聲波功率（W）、超聲時(shí)間（s）、超聲次數(shù)及提取劑pH值等因素為考察對(duì)象。在初始條件下，考察不同超聲波功率（100、200、300、400、500W）、不同超聲波工作時(shí)間（3、6、9、12、15 s，每個(gè)工作時(shí)間次數(shù)20次，間隔2 s）、不同固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、不同超聲次數(shù)（10、20、30、40、50次，超聲時(shí)間6 s）和磷酸緩沖液pH值 （分別為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0）對(duì)SOD活性的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)SOD活性影響較大的因素和水平，采用正交試驗(yàn)對(duì)SOD的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到較高的SOD活性。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同提取液對(duì)SOD活性的影響

分別以蒸餾水、0.05mol／L的磷酸鉀緩沖液（pH值為 7.8）、0.05 mol／L的磷酸鈉緩沖液 （pH值為7.8）和0.05mol／L的氯化鈉溶液為提取劑，提取粗酶液的活性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取劑對(duì)SOD活性的影響Fig.1 Effect of extractant to SOD active

由圖1可以看出，以磷酸鈉緩沖溶液為提取劑提取的SOD活性最高，其次是磷酸鉀緩沖溶液。這主要是因?yàn)?，SOD作為蛋白質(zhì)更易溶于磷酸緩沖溶液中，提取的蛋白質(zhì)含量較高，活性也較高。蒸餾水和氯化鈉溶液提取的粗酶液由于含有的蛋白質(zhì)含量較少，致使測(cè)得的酶活性較低。因此，選取磷酸鈉緩沖液作為提取劑為宜。

2.2 超聲波提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲波功率對(duì)SOD活性的影響

稱量10.0 g刺梨冷凍樣品，用榨汁機(jī)破碎打漿，然后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸鈉緩沖溶液（pH值為7.8）。最后，按照超聲時(shí)間6 s、超聲次數(shù)20次、時(shí)間間隔2 s的方式，分別調(diào)整超聲功率為100、200、300、400、500W進(jìn)行超聲提取。不同超聲功率對(duì)SOD活性的影響結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著超聲波功率的增加，粗酶提取液的活性逐漸提高，當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時(shí)，SOD活性達(dá)到最大。之后，活性隨功率的增加呈下降趨勢(shì)。由此可見，在超聲提取過程中，功率是一個(gè)重要的因素，功率越大，刺梨細(xì)胞破壁效果越好，溶出物越多。但是，一些物質(zhì)容易受到損壞。SOD是蛋白質(zhì)，其活性受其結(jié)構(gòu)的影響。在高超聲功率的情況下，SOD結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生一定的變化，從而影響酶的活性。綜合考慮，采用不高于300W的超聲功率應(yīng)提取比較合適。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)SOD活性的影響

將10.0 g冷凍刺梨樣品用榨汁機(jī)破碎打漿后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸鈉緩沖溶液 （pH值為7.8），然后按超聲功率200W，超聲時(shí)間分別設(shè)為3、6、9、12、15 s，超聲次數(shù)20次，時(shí)間間隔2 s的方式進(jìn)行超聲波提取，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)SOD活性的影響Fig.3 Effects of ultrasonic wave time to SOD active

由圖3可以看出，超聲時(shí)間對(duì)于植物細(xì)胞的破碎也是一個(gè)很重要的因素。隨著超聲工作總時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)溶出越多，粗酶提取液中SOD濃度越大，因而SOD活性逐漸上升。但當(dāng)超聲時(shí)間超過9 s后，SOD活性開始降低，超聲波效果下降。這可能是因?yàn)槌暡ㄊ且环N高能波，超聲作用時(shí)間累積也會(huì)破壞溶出物中的一些活性物質(zhì)。而SOD是酶類物質(zhì)，可能也受到一些影響，從而造成活性降低。

2.2.3 固液比對(duì)SOD活性的影響

將10.0 g冷凍刺梨樣品用榨汁機(jī)破碎打漿后，分別按固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入0.05mol／L的磷酸鈉緩沖溶液 （pH值為7.8），然后按超聲功率200W、超聲時(shí)間6s、次數(shù)20次、時(shí)間間隔2 s的方式進(jìn)行超聲波提取，其結(jié)果如圖4所示。

從圖4可知，當(dāng)固液比為1∶5時(shí)，緩沖溶液加入量比較少，超聲作用時(shí)，溶液比較黏稠，超聲效果受到影響，蛋白析出受到影響，粗酶液酶活較低。當(dāng)固液比達(dá)到1∶10時(shí)，緩沖溶液增加，濃度得當(dāng)，超聲波作用時(shí)，促進(jìn)蛋白質(zhì)析出，SOD活性最高。當(dāng)固液比繼續(xù)增加時(shí)，酶活略有下降。這說明，提取液中，蛋白質(zhì)濃度變小對(duì)后期濃縮純化將增加困難。因此，料液比1∶10左右較為合適。

圖4 固液比對(duì)SOD活性的影響Fig.4 Effects of solid-to-liquid ratio to SOD active

2.2.4 超聲次數(shù)對(duì)SOD活性的影響

稱量10.0 g刺梨冷凍樣品，用榨汁機(jī)破碎打漿后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸鈉緩沖溶液（pH值為7.8），然后按照超聲功率200W、超聲時(shí)間6 s、分別超聲10、20、30、40、50次、時(shí)間間隔2 s的方式進(jìn)行超聲提取，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲次數(shù)對(duì)SOD活性的影響Fig.5 Effects of ultrasonic wave times to SOD active

由圖5可以看出，超聲次數(shù)越多，粗酶提取液的SOD活性越大。這是由于，當(dāng)超聲次數(shù)增多時(shí)，細(xì)胞壁被破壞的可能性越大，蛋白質(zhì)溶出越多，SOD含量越高，活性越大。當(dāng)超聲次數(shù)達(dá)到30次以上，SOD活性增長(zhǎng)平緩。從能效和SOD活性保持方面考慮，不是超聲次數(shù)越多越好，因此，選擇30次較為合適。2.2.5 提取劑的pH值對(duì)SOD活性的影響

稱量10.0 g刺梨冷凍樣品，用榨汁機(jī)破碎打漿后，按固液比1∶10的比例分別加入0.05mol／L的磷酸鈉緩沖溶液（pH值分別為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0），然后按超聲功率200W、超聲時(shí)間6 s、超聲次數(shù)20次、時(shí)間間隔2 s的方式進(jìn)行超聲波提取，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取劑pH值對(duì)SOD活性的影響Fig.6 Effects of extractant pH values to SOD active

由圖6可知，pH值對(duì)SOD的活性影響較大，當(dāng)提取劑pH值為7.8時(shí)，粗酶液的SOD活性最大。每種酶都有最適pH值，刺梨SOD的最適pH值范圍為7.6～8.0。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲功率、超聲時(shí)間、固液比和超聲次數(shù)等多個(gè)因素對(duì)SOD的活性均有影響。選擇L9（34）正交試驗(yàn)，以確定超聲提取刺梨SOD的最佳工藝。其因素水平表如表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal test

由表2可知，各種因素對(duì)刺梨中SOD提取效果的影響主次順序?yàn)椋篈＞C＞D＞B，即超聲功率＞固液比＞超聲次數(shù)＞超聲時(shí)間。刺梨中SOD的超聲提取最佳工藝為：超聲功率200W，固液比1∶10，超聲時(shí)間6 s，超聲次數(shù)30次。按照該工藝提取，刺梨SOD活性為546.9U／g。

3 結(jié)語

每種酶都有其最適的pH值，研究結(jié)果表明，刺梨中SOD最適的pH值為7.6～8.0。用pH值為7.8的磷酸鈉緩沖溶液可以對(duì)刺梨中SOD進(jìn)行有效的提取。超聲波能夠在最大限度保存酶活的情況下提高其提取率。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響刺梨中SOD活性提取的因素主次順序?yàn)椋撼暪β剩竟桃罕龋境暣螖?shù)＞超聲時(shí)間。得出的超聲提取最佳工藝為：超聲功率200W，固液比1∶10，超聲時(shí)間6 s，超聲次數(shù)30次，超聲間隔2 s。超聲輔助提取技術(shù)不僅可以解決傳統(tǒng)提取技術(shù)發(fā)展瓶頸，而且可以大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品得率。實(shí)驗(yàn)通過超聲波輔助對(duì)刺梨中SOD進(jìn)行提取工藝研究，為進(jìn)一步開發(fā)研究刺梨中SOD提供了部分理論依據(jù)。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)表Table 2 L9（34）orthogonal test

［1］王振偉，胡曉冰，王愷，等.微波輔助提取刺梨中總黃酮的工藝參數(shù)優(yōu)化光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29（3）：1527-1530.

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［8］GB／T 5009.171-2003，保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定［S］.

[責(zé)任編輯 楊明慶]

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1008-486X（2015）01-0046-04

2014-07-10

2013年院級(jí)科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目：刺梨中SOD的提取純化技術(shù)及制劑工藝研究（2013KXJS011）。

王振偉（1980-），男，河南沈丘，講師，碩士，從事食品加工專業(yè)的教學(xué)與研究工作，研究方向：食品生物技術(shù)。