沈淑嬌 張志榮 曾金 陳文文 過林 賀敏 吳雨 蔣健 裘福榮

膽汁酸是膽汁的主要脂質(zhì)成分，是膽固醇在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物［1］。生物體內(nèi)，膽固醇在細(xì)胞色素P450酶(CYP7A1、CYP8B1與CYP27A1等)的催化下合成膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)等初級(jí)膽汁酸［2］，初級(jí)膽汁酸可在腸道細(xì)菌作用下，經(jīng)過7α-脫羥基生成去氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)等次級(jí)膽汁酸。以上均為游離型膽汁酸，可與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合生成甘氨膽酸(GCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、?；悄懰?TCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)等結(jié)合型膽汁酸。合成的膽汁酸通過膽道排入腸腔，經(jīng)腸道重吸收由門靜脈進(jìn)入肝臟，即經(jīng)肝腸循環(huán)實(shí)現(xiàn)大部分膽汁酸的循環(huán)利用。剩余膽汁酸經(jīng)糞便排出，在膽汁淤積時(shí)，改向從腎臟排出［3］。

膽汁酸在脂肪和脂溶性維生素的吸收中發(fā)揮重要的作用，但膽汁酸本身還具有細(xì)胞毒性，若膽汁排出受阻，其在肝內(nèi)大量淤積會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞變性和壞死，甚至導(dǎo)致肝纖維化等疾病的發(fā)生［4］。因此，了解膽汁酸在生物體內(nèi)的含量變化對(duì)于肝膽疾病的預(yù)防與治療具有重要價(jià)值。

目前，已有研究采用LC-MS/MS、HPLC-UV、GCMS 等方法測定動(dòng)物及人體血漿［5-9］、膽汁［10，11］和尿液［12］中膽汁酸的含量，但對(duì)肝臟中膽汁酸的測定報(bào)道較少。本研究建立了一種快速靈敏的LC-MS/MS法，同時(shí)檢測了小鼠肝臟中游離型及結(jié)合型膽汁酸的含量，適用于小鼠肝臟膽汁酸的測定。

材料和方法

一、藥品及試劑

膽酸(CA)、鵝去氧膽酸(CDCA)、去氧膽酸(DCA)、石膽酸(LCA)、甘氨膽酸(GCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、?；悄懰?TCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)、2，2，3，4，4-5 氘代石膽酸(D5-LCA)(美國Sigma-Aldrich公司)。

乙腈(TEDIA公司)，為色譜純;甲醇(TEDIA公司)，為色譜純;甲酸(上海試驗(yàn)試劑有限公司)，為分析純;乙酸銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，為分析純;活性炭，200目(阿拉丁試劑上海有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

二、儀器

4000 Q-TrapLC-MS/MS系統(tǒng)(美國ABI/SCIEX公司)，LC-20AD液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)，IKA-werkeTyp VX2E震蕩器(德國IKA公司)，AB135-S型分析天平(瑞士METTLER公司)，Direct-Q3純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，XHF-D高速分散器內(nèi)切式勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，Thermo超低溫冰箱(美國Thermo公司)。

三、動(dòng)物

雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠，6周齡，體質(zhì)量20～22 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(滬)2013-0016。

四、方法

(一)色譜條件 色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5 μm，150 mm ×4.60 mm);流動(dòng)相:A 為含0.05%甲酸的4 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈;流速:1 mL/min;柱溫:40℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4℃;進(jìn)樣量:10μL。梯度洗脫程序?yàn)?0 min，A∶B=70∶30;1.0 min，A∶B=65∶35;2.0 min，A∶B=65∶35;3.5 min，A∶B=10∶90;8.5 min，A∶B=10∶90;9.0min，A∶B=70∶30;14.0 min，A∶B=70∶30。

(二)質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用ESI離子源，負(fù)離子條件，多級(jí)反應(yīng)模式(MRM)監(jiān)測，離子源電壓(IS):-3500V;離子源溫度(TEM):500℃;氣簾氣(CUR):15Psi;氣體1(GS1):60Psi;氣體2(GS2):60Psi;10種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)

(三)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱量各標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，將各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液以不同比例混合制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再用乙腈依次稀釋配制7個(gè)濃度的溶液及3個(gè)濃度的質(zhì)控(低、中、高)溶液，其中TCA、TDCA、TCDCA、CA的濃度為100 ng/mL ～15 μg/mL，質(zhì)控(低、中、高)為250 ng/mL、1.5 μg/mL、12 μg/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA的濃度為20 ng/mL～3μg/mL，質(zhì)控(低、中、高)為50 ng/mL、300 ng/mL、2.4 μg/mL。內(nèi)標(biāo)濃度為 1.5 μg/mL。

(四)肝勻漿樣品處理 精密稱取50 mg肝組織，加5倍去離子水(250μL)進(jìn)行勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清50μL置1.5 mL離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液 5μL，乙腈 100μL，渦旋 5 min混勻，10 000 r/min離心兩次(每次10 min)，吸取80μL至進(jìn)樣瓶中供LC-MS/MS分析。

空白肝勻漿處理:上清肝勻漿加活性炭(100 mg/mL)［13，14］，振搖 1 h 以吸附內(nèi)源性膽汁酸，10 000 r/min離心10 min去除活性炭備用。

結(jié) 果

一、方法學(xué)確證

(一)專屬性 小鼠空白肝勻漿、小鼠空白肝勻漿添加膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品及受試小鼠的肝勻漿樣品的色譜圖分別見圖1～3。

圖1 空白肝勻漿LC-MS/MS圖

圖2 加入標(biāo)準(zhǔn)品(高濃度)和內(nèi)標(biāo)的肝勻漿LC-MS/MS圖

(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量下限(LLOQ) 精密量取“2.3”項(xiàng)下制得的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入到50uL空白肝勻漿中，配制成TCA、TDCA、TCDCA、CA 濃度為10、25、75、150、375、750、1500 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA 濃度為 2、5、15、30、75、150、300 ng/mL 的系列肝勻漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作，并進(jìn)樣分析。分別記錄各成分峰面積(AS)和內(nèi)標(biāo)峰面積(AIS)，以峰面積(AS)與內(nèi)標(biāo)峰面積(AIS)的比值Y對(duì)各成分濃度C作加權(quán)線性回歸計(jì)算(權(quán)重系數(shù)為1/C2)，結(jié)果表明各成分在范圍內(nèi)線性良好，本方法的最低定量下限(LLOQ)為0.5～10 ng/mL(見表2)。

(三)精密度與準(zhǔn)確度 按照配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法配制 TCA、TDCA、TCDCA、CA 濃度為 25、150、1 200 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA濃度為5、30、240 ng/mL的肝勻漿樣品，每批每個(gè)濃度平行配制5份樣品及一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，并進(jìn)樣分析。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)濃度，共進(jìn)行3批試驗(yàn)，計(jì)算各組分批內(nèi)及批間精密度以及準(zhǔn)確度。結(jié)果均符合要求(見表3)。

(四)提取回收率 取空白肝勻漿，按照配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法配制 TCA、TDCA、TCDCA、CA濃度為25、150、1 200 ng/mL，LCA、DCA、CDCA、GCA、GDCA、GCDCA濃度為5、30、240 ng/mL的肝勻漿樣品，每個(gè)濃度平行配制5份，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，并進(jìn)樣分析;分別記錄各成分峰面積AS1。另取空白肝勻漿，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，于上清液中精密加入與前一步等量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行配制5份，混勻離心后進(jìn)樣分析;分別記錄各成分峰面積并計(jì)算均值A(chǔ)S2。以AS1/AS2×100%計(jì)算回收率，回收率均符合要求(見表3)。

表2 膽汁酸的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及最低定量下限

表3 小鼠肝勻漿中各膽汁酸的精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率

(五)基質(zhì)效應(yīng) 取空白肝勻漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，取上清液150μL于1.5mL離心管中，分別加入低、中、高混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μL，各制備5份，混勻，10 000 r/min離心兩次(每次10 min)，取上清液，進(jìn)樣10μL分析;分別記錄各組分的色譜峰面積A1。取低、中、高混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μL，加入乙腈50μL，各制備 3份，混勻，10 000 r/min離心兩次(每次10 min)，取上清液，進(jìn)樣10μL分析;分別記錄各組分的色譜峰面積A2，計(jì)算均值。以A1/A2×100%計(jì)算準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度均值在85～115%，說明無基質(zhì)效應(yīng)。

(六)穩(wěn)定性 低、中、高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液－20℃保存2個(gè)月、肝勻漿樣品室溫放置4 h、處理后冷藏放置24 h、－20℃反復(fù)凍融3次均穩(wěn)定。

二、應(yīng)用

應(yīng)用所建立的方法，測定了6只小鼠肝勻漿中各種膽汁酸的濃度，見圖4。從測定結(jié)果可見，正常C57BL/6小鼠肝中的膽汁酸以?；撬峤Y(jié)合型(TCA、TCDCA、TDCA)及游離型CA為主，甘氨酸結(jié)合型及其他游離型濃度較低，GCDCA在線性范圍內(nèi)檢測不到。

圖4 6只小鼠肝勻漿中各膽汁酸的平均濃度(ng/g)

討 論

膽汁酸的理化特性差異較大，且存在多對(duì)同分異構(gòu)體，如鵝去氧膽酸(CDCA)與去氧膽酸(DCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)與甘氨去氧膽酸(GDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)與牛磺去氧膽酸(TDCA)，短時(shí)間內(nèi)很難達(dá)到有效的分離。本研究發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相水相中添加甲酸和乙酸銨后，分離效果及靈敏度均較理想，但酸度過高會(huì)抑制膽汁酸的離子化。經(jīng)考察，以4 mmol/L乙酸銨和0.05%的甲酸效果最理想。

膽汁酸屬于機(jī)體的內(nèi)源性物質(zhì)，無法直接獲取空白基質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)考察。已有的大部分研究報(bào)道［5-8］大都采用扣除本底的方法來消除干擾，結(jié)果顯示個(gè)體差異均較大，存在一定的誤差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。國外報(bào)道采用活性炭吸附，有效地去除了內(nèi)源性膽汁酸，減少了對(duì)檢測結(jié)果的影響［13，14］。本研究參考此方法并結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，采用150 mg/mL的用量與1 h的振搖吸附時(shí)間，經(jīng)質(zhì)譜檢測可除盡內(nèi)源性膽汁酸。

肝勻漿樣品處理選用乙腈沉淀蛋白法，只需少量樣品，方法較液液萃取和固相萃?。?，14，15］簡單快速。且相對(duì)甲醇沉淀來說，乙腈用量更少，沉淀效果更好。本方法選用同位素內(nèi)標(biāo)(D5-LCA)，因其結(jié)構(gòu)與待測膽汁酸相近，質(zhì)譜液相條件也基本一致，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。10種膽汁酸的靈敏度(LLOQ，S/N=5)可達(dá)0.5-10 ng/mL，基本滿足實(shí)驗(yàn)及臨床檢測需求，優(yōu)于國內(nèi)外的大部分報(bào)道，與國外的0.2-0.5 ng/mL(LOD，S/N=3)接近［16］。實(shí)際應(yīng)用中，由于樣品中TCA濃度超過了檢測范圍，故單獨(dú)對(duì)其進(jìn)行了稀釋后測定，稀釋精密度準(zhǔn)確度經(jīng)考察均符合要求。所建立的小鼠肝臟內(nèi)10種膽汁酸的檢測方法靈敏、快速、簡便，線性良好，精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率等均符合要求，滿足檢測需要。

本研究中檢測的10種成分涵蓋了膽汁酸在體內(nèi)的合成過程(初級(jí)、次級(jí))及存在形式(游離型、結(jié)合型)，具有代表性，且檢測時(shí)間僅為14 min，與已有的研究報(bào)道［13］比較具有一定優(yōu)勢。從檢測結(jié)果可以看出，小鼠肝臟游離型膽汁酸中初級(jí)膽汁酸CA、CDCA的濃度分別是其次級(jí)膽汁酸DCA、LCA的16倍、4.5倍，這與次級(jí)膽汁酸的生成過程相符合［3］，且CA是CDCA的16倍;結(jié)合型膽汁酸中?；撬峤Y(jié)合(T-)約為甘氨酸結(jié)合(G-)的380倍;游離型和結(jié)合型膽汁酸中均以母體CA為主，其中TCA濃度最高，為CA的12倍，GCA的357倍。

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(本文編輯:賴榮陶)