趙川 陳虹

·綜 述·

肝臟活檢標(biāo)本纖維化評估方法的研究進(jìn)展

趙川 陳虹

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟對抗各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積。長期慢性刺激使纖維化持續(xù)發(fā)展，最終可發(fā)展至肝硬化甚至肝癌，大大增加患者死亡率。病理診斷目前仍然是診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，對肝纖維化進(jìn)行確切地評估不僅有助于掌握疾病嚴(yán)重程度，而且對判斷疾病預(yù)后、評價(jià)治療效果都有不可替代的作用。目前臨床常用的肝纖維化分期的評估系統(tǒng)各具優(yōu)缺點(diǎn)，隨著非線性光學(xué)顯微技術(shù)發(fā)展，新的肝纖維化定量分析方法逐漸成熟。本篇文章概述了肝臟活檢標(biāo)本纖維化評估方法研究的新進(jìn)展。

一、肝纖維化機(jī)制

肝纖維化是肝臟各種慢性損傷因素導(dǎo)致的一種共同的病理結(jié)局，這些慢性損傷因素包括病毒、肝內(nèi)膽汁淤積、代謝異常、自身免疫失調(diào)、藥物及毒物等。肝纖維化實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，使正常的肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，進(jìn)而造成肝臟功能障礙及肝臟血流動力學(xué)異常。

（一）細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生

關(guān)于肝纖維化過程中ECM的細(xì)胞來源爭論已久，最近的研究表明慢性肝損傷中過度積累的ECM來源于多種細(xì)胞群，并認(rèn)為肝臟纖維化細(xì)胞（肌成纖維細(xì)胞）在這一過程中起關(guān)鍵作用［1］。肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFs）來源于肝星狀細(xì)胞（HSCs）、骨髓來源的肌成纖維細(xì)胞、匯管區(qū)成纖維細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial mesenchymal transitions，EMT）［2，3］。不同病因所致纖維化具有不同的發(fā)病機(jī)制，因而參與纖維化的主要細(xì)胞也不盡相同。盡管有多種細(xì)胞成分可分化為MFs，但起核心作用的細(xì)胞仍然是HSCs［4］。

研究發(fā)現(xiàn)HSCs起源于中胚層來源的多能間充質(zhì)干細(xì)胞（MMPC）［5］。正常情況下HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞中含有大量的維生素A和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）。當(dāng)肝臟受到慢性損傷因素刺激時(shí)，凋亡的肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤的炎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分別通過不同機(jī)制激活HSCs［1］?；罨腍SCs釋放出維生素A及GFAP，同時(shí)具有了促纖維化、促炎性反應(yīng)、收縮性、驅(qū)化性、增殖性等特點(diǎn)；另外在各種因子刺激下HSCs可以向肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)而合成并分泌大量ECM參與肝纖維化的形成。

（二）肝纖維化中的細(xì)胞外基質(zhì)

1.細(xì)胞外基質(zhì)對纖維化的正反饋調(diào)節(jié)

肝纖維化過程中產(chǎn)生的ECM的主要成分是纖維狀膠原蛋白，這些膠原蛋白使ECM成為基底膜樣而取代了正常的低密度基質(zhì)［6］。ECM還包括透明質(zhì)酸、纖連蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白等成分。ECM成分能夠直接或間接與肝臟細(xì)胞相互作用，正反饋調(diào)節(jié)肝纖維化過程，包括：HSCs的激活、肝細(xì)胞微絨毛缺失、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔消失、釋放細(xì)胞因子等，使肝臟在慢性損傷持續(xù)刺激下發(fā)生進(jìn)行性纖維化［7］。

正常情況下異常的細(xì)胞外基質(zhì)可被逐漸降解，這一過程依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）之間的平衡。MMPs能促進(jìn)ECM的降解，相反，TIMPs不僅抑制MMP對ECM的降解作用，并且抑制HSCs凋亡，促進(jìn)ECM不斷積累［8］。當(dāng)刺激因素持續(xù)存在時(shí)，ECM大量積累并且重塑異常，破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使MMPs活性降低而TIMPs活性增加，結(jié)果ECM降解減少，大量沉積于肝組織內(nèi)。

2.細(xì)胞外基質(zhì)對肝臟結(jié)構(gòu)的影響

在正常的肝組織中，細(xì)胞外基質(zhì)存在于肝竇內(nèi)皮下的Disse間隙中并形成基底膜樣結(jié)構(gòu)，正常內(nèi)皮下基質(zhì)對維持肝臟內(nèi)各種細(xì)胞的不同功能至關(guān)重要。隨著肝纖維化的發(fā)展，ECM中膠原和非膠原成分可增加至正常的3～5倍，并由低密度型膠原轉(zhuǎn)變?yōu)楦呙芏刃湍z原，使肝竇毛細(xì)血管化、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、假小葉形成，造成肝臟內(nèi)血流動力紊亂和肝細(xì)胞物質(zhì)交換障礙［9］。

二、組織病理學(xué)評估方法進(jìn)展

肝纖維化是慢性肝臟疾病的一個(gè)共同的病理改變。肝纖維化的程度是判斷慢性肝臟疾病進(jìn)展程度和評價(jià)疾病治療效果最好的指標(biāo)［10］。因此準(zhǔn)確、客觀地分析肝臟纖維化程度無論對科學(xué)研究還是對臨床治療都至關(guān)重要［11］。雖然目前肝纖維化的非創(chuàng)傷性評估方法在臨床應(yīng)用增加，包括血清生化診斷、影像學(xué)診斷、非創(chuàng)傷性綜合指標(biāo)的診斷模型等，但這些方法僅能定性評估是否存在肝纖維化，或區(qū)分輕度肝纖維化與重度肝纖維化，但不能準(zhǔn)確的區(qū)別肝纖維化的各個(gè)階段。肝臟活檢仍然是監(jiān)測肝纖維化進(jìn)展的金標(biāo)準(zhǔn)［12］。肝臟活檢組織纖維化評估方法經(jīng)過不斷改進(jìn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。隨著光學(xué)顯微技術(shù)的發(fā)展，新的顯微技術(shù)能夠?qū)Ω谓M織中膠原纖維精確測量，為纖維化評估提供了新的方法。

（一）起始階段

上世紀(jì)60年代末有學(xué)者開始對慢性肝病進(jìn)展程度進(jìn)行分期［13］，1977年該分期方法進(jìn)行了改進(jìn)［14］。1968年首次發(fā)表的分期方法將慢性肝炎分為慢性持續(xù)性和慢性進(jìn)展性兩種［13］。Popper and Schaffner肯定了肝臟活檢在慢性肝炎的診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值，并強(qiáng)調(diào)炎癥分布區(qū)域的描述，包括：慢性小葉、慢性匯管區(qū)和慢性匯管周圍炎癥等，但后者沒能體現(xiàn)出病因的重要性［16］。在這一階段并沒有形成系統(tǒng)性的肝纖維化評估方法。

（二）發(fā)展階段

隨著對慢性肝臟疾病的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制、病理變化、臨床表現(xiàn)等的全面認(rèn)識，對疾病進(jìn)展程度的分期更加合理，主要考慮到病因、肝組織的炎癥分級和纖維化分期三個(gè)因素。1981～1996年間，在原有病理評分方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，先后提出了五個(gè)慢性肝臟疾病嚴(yán)重程度的病理評分系統(tǒng)：HAI評分系統(tǒng)［17］、Scheuer評分系統(tǒng)［18］、Ishak評分系統(tǒng)［19］、Metavir評分系統(tǒng)［20］和Ishak改進(jìn)的HAI系統(tǒng)［21］。目前廣泛應(yīng)用于臨床。

以上評估方法雖然能夠較為系統(tǒng)、客觀的對纖維化程度作出半定量評估，但這些評分系統(tǒng)基本上都是以慢性病毒性肝炎為模型建立的，應(yīng)用于其他病因所致肝纖維化的評估時(shí)有不同程度的局限性［22］。此外，上述方法是基于對肝組織病理切片的免疫組化染色結(jié)果的閱讀，由病理專家給出評分。因此除了肝臟穿刺活檢固有的創(chuàng)傷性之外，傳統(tǒng)的纖維化評估方法還存在讀片者本身及讀片者之間的主觀性差異、染色劑濃度影響及光漂白等缺點(diǎn)，使客觀性、精確性、可重復(fù)性等受到影響。

（三）新進(jìn)展階段

近年來有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用非線性光學(xué)顯微技術(shù)——二次諧波產(chǎn)生（SHG）和雙光子激發(fā)熒光（TPEF），結(jié)合計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)對肝活檢標(biāo)本進(jìn)行全自動纖維化評估的方法［23］。這種方法基于肝組織自身熒光的存在，不需染料染色，克服了傳統(tǒng)評估方法的很多缺點(diǎn)，能夠更加準(zhǔn)確、客觀、定量、快速地對纖維化做出評估。

1.SHG/TPEF光學(xué)原理簡介

外部可調(diào)節(jié)的鎖模藍(lán)色激光共聚焦圖像系統(tǒng)是SHG/ TPEF的技術(shù)基礎(chǔ)，如圖1所示。激光首先通過脈沖壓縮器（PC）和聲光調(diào)節(jié)器（AOM），分別用來減少激光的全速分散和能量衰變。然后激光經(jīng)分色鏡（DM），被折射的部分激光通過物鏡到達(dá)非染色組織切片。組織中產(chǎn)生的TPEF位置指示信號被該物鏡收集，并通過一個(gè)分色鏡和一個(gè)500～550 nm波長的帶通濾波片后被光電倍增管（PMT）記錄。SHG信號被一個(gè)聚光器收集，并在被PTM檢測前經(jīng)450nm波長的電通濾波片濾過。由于這種非線性光學(xué)過程內(nèi)在的光學(xué)選擇特性，不需使用共聚焦顯微鏡的針孔作用［24］。

2.組織標(biāo)本圖像的采集、處理優(yōu)勢

利用膠原的內(nèi)在特性，SHG顯微技術(shù)可以更加敏感地獲取非染色肝組織中膠原的定量信息。其優(yōu)點(diǎn)是能夠檢測到膠原結(jié)構(gòu)及其在纖維化早期的重塑過程［25］。另有研究發(fā)現(xiàn)，抗纖維化治療后肝組織在傳統(tǒng)組織評分中未能發(fā)現(xiàn)明顯變化而SHG顯微技術(shù)則能檢測到膠原減少［26］。不僅如此，SHG顯微成像能夠描述組織切片中膠原的三維空間分布，可以精確描述膠原蛋白在不同區(qū)域的增加強(qiáng)度［27］。將SHG顯微技術(shù)與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)相結(jié)合，可將組織圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字化信息，實(shí)現(xiàn)膠原的全自動定量分析。

圖1

在激光下肝細(xì)胞內(nèi)分子（NADPH、黃素等）產(chǎn)生的大量熒光可被TPEF記錄。肝損傷過程中由于肝細(xì)胞變性、壞死而使細(xì)胞核、胞漿、脂滴聚集區(qū)域缺乏熒光顆粒，在TPEF中顯示為暗區(qū)，因而TPEF適用于肝細(xì)胞形態(tài)的觀察［28］。

目前已有商品化的SHG/TPEF顯微儀器，可方便快速地采集組織信息并將組織圖像信息轉(zhuǎn)化成數(shù)字圖像與計(jì)算機(jī)相結(jié)合，直接分析組織切片中膠原和壞死性炎癥的情況［29］，對肝纖維化程度進(jìn)行評估。新的纖維化評估方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：不需要組織染色和人工閱讀病理切片，避免了染色劑、觀察者的影響而具有更好的可重復(fù)性；可根據(jù)不同病因所致纖維化模型調(diào)整分析參數(shù)、建立模型，使評估更加標(biāo)準(zhǔn)化；可將成像系統(tǒng)與計(jì)算機(jī)相連結(jié)合，實(shí)現(xiàn)全自動定量評估；可以獲得膠原的三維空間結(jié)構(gòu)及分布信息，使評估更加精確、連續(xù)。

三、小結(jié)與展望

肝纖維化是不同病因所致慢性肝臟疾病的一個(gè)共同的病理過程，其實(shí)質(zhì)是肝組織中ECM的過度積累。為判斷疾病嚴(yán)重程度、評價(jià)治療效果、判斷預(yù)后，必須準(zhǔn)確、客觀地評估肝臟纖維化情況。傳統(tǒng)的評估方法各具優(yōu)缺點(diǎn)，SHG/TPEF顯微技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)方法的部分缺點(diǎn)，而且具有更多優(yōu)勢。

目前已有SHG/TPEF用于臨床慢性乙型肝炎肝纖維化的病理評估模型的報(bào)道，可用于乙肝肝纖維化評估，相信該技術(shù)會很快應(yīng)用于其他病因所致肝纖維化的評估中。另外由于SHG/TPEP的靈敏性、連續(xù)性等特點(diǎn)，不僅可用于疾病診斷、分期，還使治療效果的檢測更準(zhǔn)確，并有助于新的抗纖維化藥物研發(fā)和優(yōu)化病人個(gè)體化治療方案。

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2014-12-19）

（本文編輯：魏清）

100039 武警總醫(yī)院移植研究所

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