吳敏

·臨床與基礎(chǔ)研究·

慢性乙型肝炎患者病毒載量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平的相關(guān)性

吳敏

目的 探討IFN-γ、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量的相關(guān)關(guān)系。方法 收集感染科2012年6月到2014年2月的門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，同時選取在我院體檢正?；蛘叻歉窝撞《靖腥净颊?0例作為對照組，熒光定量PCR法定量病毒載量，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體法檢測IFN-γ、IL-10水平及熒光染色測定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA定量相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 病例組的IFN-γ水平低于對照組，而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA陰性、低拷貝、高拷貝間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IFN-γ與HBV DNA定量間呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（IL-10 r=0.362、CD19+r= 0.348，P＜0.05）。結(jié)論 IFN-γ水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作為乙型肝炎患者發(fā)生炎癥特異指標。

IFN-γ；IL-10；CD19+水平；慢性乙型肝炎患者；相關(guān)性

乙型肝炎是嚴重血液傳播性疾病，在世界各地均有發(fā)生，據(jù)統(tǒng)計全世界超過一半人感染過乙型肝炎病毒，而我國是高發(fā)地區(qū)，危害嚴重［1］。乙型肝炎分為慢性和急性兩種類型，而超過多一半的為慢性乙型肝炎［2］。慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒檢測為陽性，病程超過半年或發(fā)病日期不明確并且臨床為臨床表現(xiàn)為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀者［3］，乙型肝炎可以發(fā)生各個年齡段，主要傳播途徑有血液傳播、性傳播、母嬰傳播，一般得了都難以治愈，嚴重威脅者人們的生活質(zhì)量和生命健康。現(xiàn)在大部分研究表明乙型肝炎病毒對肝傷害是通過介導(dǎo)免疫損傷后間接對肝造成損傷［4］，所以研究免疫因子與病毒載量間關(guān)系至關(guān)重要?，F(xiàn)將我院感染科收集的2012年6月至2014年2月的門診及住院慢性乙型肝炎患者80例，應(yīng)用相應(yīng)檢測方法分析病毒定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平相關(guān)性，報道如下。

資料和方法

一、一般資料

收集我院感染科2012年6月到2014年2月的門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，其中男47例，女33例，年齡在20～75歲，平均（47.38±4.79）歲，病程2月～2年，平均（1.23±022）年。同時選取在我院體檢正常或者非肝炎病毒感染患者50例作為對照組，其中男26例，女24例，年齡在19～70歲，平均（46.23 ±4.37）歲。納入標準：①所有患者均符合慢性乙型肝炎臨床診斷金標準，即符合第十二次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議上通過的《慢性乙型肝炎防治指南》。②患者不合并其他嚴重并發(fā)癥，或者內(nèi)分泌性疾病，或者惡性腫瘤等疾病，未服用可能對研究的指標有影響的藥物，比如未抗病毒治療等。③慢性乙型肝炎病毒感染不合并其他肝炎病毒感染，以及沒有肝臟疾病史。④符合倫理道德，家屬或者患者簽署了知情同意書等。排除標準：①患有嚴重器官衰竭性疾病，或者內(nèi)分泌性疾病，比如：肝腎衰竭、糖尿病等。②患者正在接受抗病毒治療，以及合并其他肝炎病毒感染，同時可能患有影響IFN-γ、IL-10、CD19+水平的非肝炎疾病。③對本次研究不依從、不配合以及拒絕參加試驗者，或者研究過程中不按照規(guī)定進行檢查，或者在調(diào)查過程中采用了其他的治療的措施的患者及轉(zhuǎn)院治療患者。④在治療過程中病情突然的加重不能在參加試驗的。病例組和對照組，一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

二、儀器與試劑

美國biotek酶標儀、流式細胞檢測儀（貝克曼EpicsXL檢測系統(tǒng)）、熒光檢測儀（熒光定量核酸檢測儀）、離心機（貝克曼庫爾特Optima XPN）；ELISA雙抗體檢測試劑盒（IFN-γ：鄭州安賽生物科技有限公司、IL-10試劑盒：上海西唐生物科技有限公司）、CD19+藻紅蛋白（PE）單抗試劑（美國COULTER原裝配套）、杜邦聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒、達安DA7600 PCR儀、乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑、HBV DNA定量檢測試劑盒（珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司）。

三、研究方法

（一）標本來源

采取患者空腹靜脈血4 m L，3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，-70℃保存待用；再采取2 m L EDTA-K2抗凝靜脈血用于檢測CD19+。

（二）HBV DNA水平定量檢測

應(yīng)用熒光定量PCR法，儀器為達安DA7600 PCR儀。具體步驟：①血樣RNA的抽提：解凍；提取血清細胞；兩相分離（離心后混合液體將分為下層紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層）。RNA沉淀（RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊）；RNA清洗；RNA干燥；溶解RNA沉淀。②RNA質(zhì)量檢測：紫外吸收法測定，先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1∶100）后，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。③樣品cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、d NTP 0.1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μL、DEPC水5μL、RNA模版2μL、總體積10 μL。④樣品管家基因?qū)崟r定量PCR。⑤模板，針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。⑥PCR，所有c DNA樣品分別配置實時定量PCR反應(yīng)體系。⑦引物設(shè)計（應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件）。⑧電泳，各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，Gold View染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。結(jié)果判斷：≥103拷貝/mL為陽性（低拷貝：103～106拷貝/ mL，高拷貝：＞106拷貝/mL），＜103拷貝/m L為陰性。

（三）IFN-γ、IL-10、CD19+水平檢測

IFN-γ、IL-10水平檢測：ELISA雙抗體法檢測，嚴格按照試劑盒使用說明書操作，使用酶標儀450 nm檢測吸光度值，通過標準曲線計算標本中的濃度。CD19+水平檢測：嚴格按照操作說明進行，首先100μL抗凝血于試管中，加入20μL PE熒光標記抗體，室溫反應(yīng)20 min，加入一定量細胞裂解液，反應(yīng)15 min，加入500μL鞘液混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入500μL鞘液，混勻后檢測染色陽性，計算CD19+水平。

四、研究指標

病例組與對照組IFN-γ、IL-10、CD19+水平比較；IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA水平之間相關(guān)性關(guān)系。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行，計量資料以均值±標準差表示，檢驗符合正態(tài)分布的，行兩組之間的t檢驗，多個均值間比較應(yīng)用方差分析；計數(shù)資料用百分比表示，采用卡方檢驗（χ2）；應(yīng)用pearson檢驗分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA之間相關(guān)關(guān)系。取P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎(chǔ)指標比較

病例組和對照組性別、年齡等基礎(chǔ)指標之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；病例組的IFN-γ水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

二、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與病毒載量之間相關(guān)關(guān)系

經(jīng)過HBV DNA定量檢測80例患者中其中HBV DNA陰性（＜103拷貝/m L）23例、HBV DNA陽性（≥103拷貝/mL）57例，其中低拷貝的29例，高拷貝的28例。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在三種類型之間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。IFN-γ與HBV DNA定量間呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（IL-10r= 0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），見圖1、2、3。

表1 兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎(chǔ)指標比較

表1 兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎(chǔ)指標比較

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表2 HBV DNA對數(shù)定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平關(guān)系

表2 HBV DNA對數(shù)定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平關(guān)系

注：*與HBV DNA陰性間比較P＜0.05；#與低拷貝間比較P＜0.05

類別例數(shù)HBV DNA定量（拷貝/mL）IFN-γ（pg/m L）IL-10（pg/mL）CD19+（%）HBV DNA陰性23 3.12±1.24 726.24±235.18 427.28±127.89 10.89±2.26低拷貝29 5.78±1.35*613.27±220.75*564.25±144.67*13.15±2.31*高拷貝28 7.61±1.69*#421.37±198.35*#756.26±154.37*#15.58±3.15*#F -10.234-16.235 21.235 14. 000 231 P -0.001 0.000 0.000 0.

圖1 HBV DNA對數(shù)定量與IFN-γ間散點圖

圖2 HBV DNA對數(shù)定量與IL-10水平間散點圖

圖3 HBV DNA對數(shù)定量與CD19+水平間散點圖

討 論

乙型肝炎病毒感染是所有肝炎中占有比例最高的，也是影響人們生命質(zhì)量最重要的一種，現(xiàn)在臨床上對于乙型肝炎的研究也較多，從它的發(fā)生發(fā)展各個方面都有所深入，但是對于HBV引起肝臟病變?nèi)绾螕p傷機體還沒有一個明確認識［5］。大量文獻資料表明只有HBV引起免疫損傷才能出現(xiàn)肝臟病變，細胞免疫、體液免疫及可能出現(xiàn)的自身免疫相互關(guān)聯(lián)參與發(fā)病才能引起疾病，不同疾病類型以不同的免疫反應(yīng)為主［6-7］。對于慢性肝炎主要是由于細胞免疫異常導(dǎo)致，有三種效應(yīng)細胞分別為自然殺傷細胞（NK）、細胞毒性T細胞（TC）及抗體依賴淋巴細胞［8］。其中免疫調(diào)控細胞即輔助性T細胞（TH）與抑制性T細胞（TS）其功能低下或亢進均引起免疫紊亂。輔助性T細胞（TH）分為Th1和Th2亞群，Th1分泌IFN-γ、IL-10等細胞因子介導(dǎo)細胞免疫，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，可介導(dǎo)體液免疫，而CD19+與B淋巴細胞有關(guān)［9-10］，所以研究血液中病毒載量與細胞因子之間關(guān)系對于臨床診斷和治療有很大的作用。

本文收集我院感染科2012年6月到2014年2月門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，以及選取我院體檢正?；蛘叻歉窝撞《靖腥净颊?0例作為對照，應(yīng)用熒光定量PCR法定量病毒載量，ELISA雙抗體法檢測IFN-γ、IL-10水平及熒光染色測定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA定量相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示病例組的IFN-γ水平低于對照組，而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IFN-γ水平降低、IL-10與CD19+升高說明患者同時發(fā)生了細胞免疫和體液免疫。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA陰性、低拷貝、高拷貝間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可能說明病毒含量越高刺激機體發(fā)生免疫反應(yīng)越嚴重，當機體不能耐受就會造成相應(yīng)危害，其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。IFN-γ與HBV DNA定量間呈負相關(guān)關(guān)系（r= -0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（IL-10 r=0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），這些指標與病毒載量之間關(guān)系只是在小樣本特定地區(qū)群體中的關(guān)系，現(xiàn)在也沒有一個世界性多中心的相關(guān)研究，所以結(jié)果可供參考。

綜上所述，IFN-γ水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作為乙型肝炎患者發(fā)生炎癥特異指標，可以通過檢測這些指標變化推斷病毒載量的情況及感染情況，進而可以制定相應(yīng)的治療和預(yù)防措施。

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2014-11-06）

（本文編輯：馮珉）

201508 上海市金山區(qū)復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院臨床檢驗科