小鵝瘟的瓊脂擴(kuò)散試驗操作

吳洪濤1，吳佳寧2

(1.遼寧省重大動物疫病應(yīng)急中心110000;2.沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心110000)

瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)是血清學(xué)沉淀試驗的一種，以瓊脂凝膠作為抗原抗體免疫擴(kuò)散和形成沉淀反應(yīng)的載體。瓊脂凝膠的含水量在90%以上，能允許分子量在200000以下的大分子物質(zhì)自由通過和擴(kuò)散，絕大多數(shù)的可溶性抗原與免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散。若特異的抗原、抗體在凝膠中各以其固有的擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散，當(dāng)兩者在比例最合適的區(qū)域內(nèi)相遇，反應(yīng)生成的沉淀物的顆粒較大，停留在凝膠中不再擴(kuò)散，即發(fā)生沉淀反應(yīng)形成不透明的白色沉淀線。小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗，可用標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測血清抗體，亦可用標(biāo)準(zhǔn)血清檢測GP抗原，前者陽性檢出率為100%，后者檢出率達(dá)50%以上。

1　實驗儀器、設(shè)備及材料

標(biāo)準(zhǔn)GP抗原：將已知GPV種毒按1∶10稀釋，接種于12～14日齡的無相應(yīng)抗體的鵝胚尿囊腔內(nèi)，0．2mL/只，繼續(xù)孵化，每天照蛋，收集接種后72～120小時死亡胚，氣室向上靜置4℃冰箱4～12小時，收獲尿囊液及具有典型病變的胚體，取l份胚體，2份尿囊液搗碎制成勻漿，加等量三氯甲烷(氯仿)震搖30min，以3500轉(zhuǎn)/min離心30min，吸取上清液裝入透析袋，包埋于干燥硅膠中越夜，至袋內(nèi)溶液完全干燥，向袋內(nèi)加入原液容量1/20的去離子水，使內(nèi)容物溶解，即為沉淀抗原。

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：小鵝瘟高免血清。

被檢抗原：無菌采取具有典型病變的患病雛鵝肝組織，搗碎加2倍量離子水，制備成組織懸液，參照制各標(biāo)準(zhǔn)GP抗原方法用氯仿處理硅膠包埋濃縮加入原懸浮1/20的去離子水為被檢抗原。

被檢血清：受檢雛鵝血液自然析出的血清。

凝膠配方：瓊脂糖：0.7～1.2g，氯化鈉 8g，苯酚0.1mL，蒸餾水 100mL。凝集制備：將各種試劑依次加入后，用5.6%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 值6.8～7.6，水浴加熱使瓊脂糖充分溶解。將溶化的瓊脂凝膠傾注于清沽的玻板上或平皿，制成厚度約為3mm的瓊脂凝膠板。注意不要產(chǎn)生氣泡。打孔方法同馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散試驗。

打孔：在制備好的瓊脂凝膠扳上打孔，其打孔圖形按需要而定，一般采用七孔梅花圖形，操作時，先用一張與凝膠板大小相仿的白紙片，按要求畫好打孔圖形，然后，將圖形放在凝膠板底下，用打孔器依樣打孔。

2　實驗步驟

方法一：用GB標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測受檢血清GB抗體。用移液管吸取標(biāo)準(zhǔn)GB抗原加入中心孔內(nèi)，外周任何兩個相對孔加入GB標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其余各外周孔加入各被檢鵝的血清，容量以平孔面為度，注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點樣順序。所有樣本加入完畢，放入濕盒35～37℃恒溫中過夜，次日(24h)觀察并記錄結(jié)果。

方法二：用GB標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測GB抗原。用移液器吸取GB標(biāo)準(zhǔn)陽性血清加入中心孔內(nèi)，外周任何相對的兩孔加入標(biāo)準(zhǔn)GB抗原，其余外周孔分別加入受檢鵝組織處理液，加入量以平孔面為度。注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點樣順序。所有樣品加完后，放入溫盒置35～37℃恒溫箱中過夜，次日觀察并記錄結(jié)果。

3　結(jié)果判定

若受檢血清有GB特異抗體或受檢組織含有GB病毒抗原，則在抗原與抗體孔之間產(chǎn)生肉眼可見的清晰的白色沉淀線，此為陽性反應(yīng)。相反，如抗原、抗體之間不出現(xiàn)沉淀線則為陰性。

沉淀線一般出現(xiàn)在抗原抗體孔之中間，但有時由于抗原濃度與抗體濃度不一，沉淀線往往偏近抗原孔或抗體孔，有時可能出現(xiàn)一條以上的沉淀線，這些情況均屬陽性反應(yīng)。

如果被檢孔沒有出現(xiàn)白色沉淀線，但鄰接的陽性對照孔的沉淀線末端向該被檢孔內(nèi)側(cè)偏彎，可認(rèn)為該被檢孔樣品為陽性：若鄰近的陽性對照孔的沉淀線末端向該被檢孔直伸或一向其外側(cè)偏彎，或該被檢孔雖然有沉淀線，但該沉淀線與陽性對照孔沉淀線交叉(屬非特異性沉淀線)，則此被檢樣品為陰性。

理論上，大多數(shù)傳染病都可應(yīng)用AGP試驗作檢驗，目前常應(yīng)用AGP試驗檢測的家禽傳染病還有雞馬立克氏病、傳染性法氏囊病、家禽腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)、滑液囊霉形體病、禽流感、禽霍亂等，基本原理和方法同上，具體操作可按試劑說明書進(jìn)行。