周 偉、易榮大、彭 文、孫 磊、亓振國(guó)、江立新

(合肥天麥生物科技發(fā)展有限公司，合肥 230601)

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周 偉、易榮大、彭 文、孫 磊、亓振國(guó)、江立新*

(合肥天麥生物科技發(fā)展有限公司，合肥 230601)

目的：分析小分子多肽抑肽酶的相對(duì)分子質(zhì)量。方法：用Tricine-SDS-PAGE法，采用三羥甲基氨基甘氨酸(Tricine)代替甘氨酸作為尾隨離子，用來(lái)檢測(cè)小分子多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算抑肽酶分子量分別為6 487.5 Da(1 μg)、6 677.6 Da(2 μg)，接近真實(shí)值。結(jié)論：本方法能夠消除由于多肽分子與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的不同帶來(lái)的誤差，并克服了普通SDS-PAGE小分子蛋白條帶帶型彌散的缺點(diǎn)。

Tricine-SDS-PAGE，小分子多肽，抑肽酶，相對(duì)分子質(zhì)量

抑肽酶(aprotinin) 是一種Kunitz型蛋白酶抑制劑,由58個(gè)氨基酸組成,分子量6 512 Da,等電點(diǎn)為pH 10.5,通過(guò)3對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。天然抑肽酶的第15位賴氨酸是其活性中心, 參與和多種絲氨酸蛋白酶催化中心的特異結(jié)合，是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制如胰蛋白酶、糜乳蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、組織激肽釋放酶等多種酶的活性，用途十分廣泛[1-3]。需要控制這些酶活性或適時(shí)終止這些酶切反應(yīng)時(shí)，可以選擇抑肽酶。因而，有必要建立簡(jiǎn)單快速定性或定量檢測(cè)抑肽酶的方法。

國(guó)內(nèi)對(duì)小分子量蛋白的分子量檢測(cè)長(zhǎng)期采用凝膠色譜法[4,5]，但該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)蛋白質(zhì)的分子空間構(gòu)象的一致性要求較高[6]，操作較復(fù)雜，測(cè)定所需時(shí)間較長(zhǎng)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，簡(jiǎn)稱 SDS電泳，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量。與層析方法(凝膠過(guò)濾)相比，其不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，能在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，有較高的重復(fù)性，且不需要非常純的樣品(取決于樣品的組成和對(duì)結(jié)果的要求)，是目前所接受的用于測(cè)定亞基分子量的一種最好的方法。常規(guī)甘氨酸(Glycine)-SDS-PAGE能分離10～200 kDa的蛋白大分子，而對(duì)10 kDa以下的抑肽酶(6 512 Da)分辨率低，且極易擴(kuò)散丟失，無(wú)著色帶。本試驗(yàn)擬建立一套分析小分子多肽抑肽酶的Tricine-SDS-PAGE方法。Tricine-SDS-PAGE采用Tricine (三羥甲基氨基甘氨酸)代替甘氨酸作為尾隨離子，用來(lái)檢測(cè)小分子多肽分子量，消除由于多肽分子與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的不同帶來(lái)的誤差，克服了普通SDS-PAGE小分子蛋白條帶帶型彌散的缺點(diǎn)[7]，定量準(zhǔn)確；通過(guò)試驗(yàn)摸索，確定采用兩層不連續(xù)SDS-PAGE，與通行Tricine-SDS-PAGE相比無(wú)需灌注夾層膠，操作簡(jiǎn)單，有一定推廣應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 PowerPac Basic電泳電源、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Criterion Cell垂直電泳槽(BIO-RAD公司)；POS-300平板搖床(Grant-Bio公司)；Mili-Q超純水機(jī)(密理博公司)。丙烯酰胺(上海生工，批號(hào)LY0320B0213J)，甲叉雙丙烯酰胺(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)20111012)，十二烷基磺酸鈉(SDS，sigma，批號(hào)BCBH3065V)，四甲基乙二胺(TEMED，合肥博美，批號(hào)HFBII15012010528)，考馬斯亮藍(lán)R-250(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)W20110926)，過(guò)硫酸銨(APS，國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)F20111213)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)20120327)，三羥甲基甲基甘氨酸(Tricine)、2×Tricine Loading Buffer(上海生工生物工程有限責(zé)任公司)；甲醇為分析純，乙酸為優(yōu)級(jí)純；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品P0032-1(6 200～66 200 Da，蘭旭生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 電泳貯存液的制備 按表1和表2配制陽(yáng)極緩沖液、陰極緩沖液、凝膠緩沖液以及不同濃度的丙烯酰胺貯存液備用。

表1 電泳緩沖液

表2 丙烯酰胺儲(chǔ)存液

1.2.2 凝膠配制 依照表3給出的數(shù)據(jù)分別配制分離膠和濃縮膠。

表3 凝膠配方

1.2.3 樣品制備 稱取抑肽酶凍干粉適量，加入超純水分別配制成0.2和0.1 mg/ml的溶液，各取10 μl，分別加入等體積的2×Tricine Loading Buffer，中速渦旋混勻后室溫靜置15 min。

1.2.4 電泳條件及凝膠染色脫色處理 采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，上、下層儲(chǔ)液槽分別裝入陰、陽(yáng)極緩沖液。用微量移液器小心吸取20 μl處理好的抑肽酶樣品及標(biāo)準(zhǔn)分子量多肽，加入點(diǎn)樣孔。恒流10 mA電泳約30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)節(jié)至40 mA，運(yùn)行約2 h，停止電泳。使用0.125%的考馬斯亮藍(lán)染色液，室溫震蕩染色約1 h，棄去染色液，加入純化水約200 ml，微波爐高火加熱3 min脫色，重復(fù)5次。

2 結(jié)果

Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)中，使用16% T、6% C的分離膠能使各條帶帶型緊致無(wú)擴(kuò)散。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)其在分離膠中遷移的距離進(jìn)行直線回歸分析，回歸方程為Y=-1.31X+4.79(R2=0.975 6)，線性范圍為6 200～66 200 Da。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算抑肽酶分子量分別為6 487.5 Da(1 μg)和6 677.6 Da(2 μg)，接近真實(shí)值，見(jiàn)圖1。

圖1 16% TricineSDSPAGE電泳照片

3 討論

Tricine-SDS-PAGE電泳方法重復(fù)性好，條件穩(wěn)定，可有效分離分子量小于10 kDa的抑肽酶，為小分子量多肽研究作參考。然而不同的實(shí)驗(yàn)樣本需要考慮到不同的濃縮膠和分離膠的濃度。

SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比率的增加而減小，比率接近于 1∶20時(shí)，孔徑達(dá)到最小值。分子量低于10 kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE也得不到很好的分離。在含SDS緩沖液的樣品中，小分子多肽的濃縮是較困難的，這是因?yàn)樾》肿佣嚯呐cSDS形成的復(fù)合體具有和SDS本身類似的電荷和大小，因此濃縮對(duì)于小分子多肽的SDS-PAGE來(lái)說(shuō)就成了一個(gè)突出的問(wèn)題。上述方法中Tricine以陽(yáng)離子形式存在可以作為拖尾離子，使小分子多肽能夠在濃縮膠中形成盡可能窄的帶。

此外，快速的固定、染色和脫色對(duì)于小分子多肽電泳是必要的。這主要是由于小分子多肽對(duì)染料的結(jié)合力較弱，易擴(kuò)散沖洗掉而著色較差[7]，另外分離膠中添加尿素更會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象的加劇。采用純化水高溫脫色，可以避免銀染的煩瑣，及高濃度考染耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[8],短時(shí)間內(nèi)高質(zhì)量地完成凝膠脫色。

1 Robert S, Wagner B K, Boulanger M,etal.Aprotinin[J]. The Annals of Pharmacotherapy,1996, 30(4) : 372-380

2 Grzesiak A, Krokoszynska I, Krowarsch D,etal.Inhibition of six serine proteinases of the human coagulation system by mutants of bovine pancreatic trypsin inhibitor[J]. The Journal of Bio logical Chemistry, 2000, 275(43) : 33346-33352

3 孔毅,喬德水. 重組人胰島素生產(chǎn)工藝監(jiān)控方法研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2003,10(2):121-124

4 遲玉杰.實(shí)用蛋白質(zhì)制備技術(shù)[M].哈爾濱：哈爾濱理工大學(xué)出版社，1999：91-106

5 侯洋, 靳曉霞, 孫繼，等. 凝膠色譜測(cè)定水處理用聚合物分子量及其分布的方法研究[A]. 2013中國(guó)水處理技術(shù)研討會(huì)暨第33屆年會(huì)論文集.2013：386-392

6 Sehagger H，von Jagow G．Trieine-sodium dodeeyl sulfate-polyaerylamidgelelectroporesis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa[J]．Analytical Biochemistry，1987，166：368-379

7 石繼紅，趙永同，王俊櫻.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析小分子多肽[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000，21(6)：761-763

8 楊聯(lián)萍,孔祥平,易學(xué)瑞. SDS-PAGE電泳對(duì)小分子多肽的分析[J].生物工程進(jìn)展，1998，18(6)：49-51

2015-02-05

R927.11

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1006-5687(2015)03-0011-03

*通訊作者：江立新，E-mail：jianglixin@htbt.com.cn。