朱樹人(山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250017;上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200241)

孟慶磊，孫玉旋，張延華，朱永安(山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250017)

基于線粒體16S rRNA基因序列的鱧屬魚類系統(tǒng)進(jìn)化探討

朱樹人(山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250017;上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200241)

孟慶磊，孫玉旋，張延華，朱永安(山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250017)

[摘要]對(duì)4種鱧屬(Channa)魚類共108個(gè)個(gè)體的16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)比對(duì)校正得到572bp(C.striata)和573bp(C.argus,C.maculata,C.asiatica)的基因片段,共檢測(cè)到10個(gè)單倍型,4種鱧所有單倍型之間共存在1個(gè)插入/缺失;此外有63個(gè)變異位點(diǎn),其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)60個(gè),序列表現(xiàn)出明顯的A偏倚;多態(tài)位點(diǎn)比例為11.2%;序列中轉(zhuǎn)換多于顛換,轉(zhuǎn)換/顛換之比為1.4?；贙imu-ra雙參數(shù)法,計(jì)算的種間遺傳距離介于0.021[烏鱧(C.argus)與斑鱧(C.maculata)之間]到0.079[烏鱧(C.argus)與線鱧(C.striata)之間、斑鱧(C.maculata)與線鱧(C.striata)之間]。以非洲真副鱧(Parachannainsignis)為外群構(gòu)建的NJ樹和ML樹中,線鱧位于進(jìn)化樹的基部,表明線鱧是最早分化出來的種;進(jìn)化樹顯示烏鱧和斑鱧親緣關(guān)系最近,表明2個(gè)種分化較晚。

[關(guān)鍵詞]線粒體DNA;16SrRNA;鱧屬;系統(tǒng)進(jìn)化

鱧科魚類隸屬于鱸形目，僅包括鱧屬(Channa)和副鱧屬(Parachanna)2個(gè)屬。鱧屬有26個(gè)種，原產(chǎn)于亞洲，主要是東南亞；副鱧屬有3個(gè)種，來自熱帶非洲[1,2]。因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有生肌補(bǔ)血、斂瘡生肌、促進(jìn)傷口愈合等藥用價(jià)值，富含人體所需的鈣、磷、鐵、鋅等多種微量元素，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[3～5]。前人對(duì)鱧科魚類分類的研究偏重于形態(tài)比較方面[6]，然而形態(tài)特征容易受環(huán)境影響，且隨著更多的鱧科魚類被發(fā)現(xiàn)[7～9]，僅從形態(tài)特征對(duì)這些物種進(jìn)行分類和親緣關(guān)系分析，會(huì)有一定的偏差。

與核DNA相比，線粒體DNA具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速度較快、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn)。因此作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于分子進(jìn)化、物種鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生研究中[10～12]。16S基因是線粒體DNA很重要的基因片段，易擴(kuò)增并且序列比較保守，因此常用于物種鑒定及種群遺傳多樣性分析，在魚類研究中已經(jīng)廣泛得到應(yīng)用[13～15]。本研究通過對(duì)中國(guó)常見的4種鱧科魚類——烏鱧(C.argus)、斑鱧(C.maculata)、月鱧(C.asiatica)和線鱧(C.striata)的線粒體DNA 16S rRNA基因片段序列進(jìn)行測(cè)定，對(duì)4種鱧科魚類的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為鱧屬魚類的分子水平的系統(tǒng)學(xué)研究及種間雜交提供參考。

1材料與方法

1.1　材料

4種鱧屬魚類樣品于2013年5～10月份采集。烏鱧樣品采集于4個(gè)湖泊(鄱陽(yáng)湖、洞庭湖、微山湖、太湖)和1個(gè)江域(錢塘江)，斑鱧樣品采自福建和廣東，月鱧和線鱧樣品都采自廣東。每個(gè)群體采集12尾。樣本均購(gòu)自水上作業(yè)的漁民或附近的水產(chǎn)品市場(chǎng)，剪取少量胸鰭，保存于無(wú)水乙醇中，貼好標(biāo)簽置于4℃冰箱備用。

1.2　DNA提取及PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)前將胸鰭組織從酒精中取出，充分漂洗晾干并剪碎，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿法提取基因組DNA。提取的DNA取2μL用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并稀釋到合適濃度用于PCR擴(kuò)增。

用于擴(kuò)增線粒體DNA的16S rRNA 基因片段的引物序列為：16SA 5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′[16]；16SB 5′-CCG GTT GAA CTC AGA TCA-3′[17]，引物合成時(shí)前面加M13接頭。

PCR反應(yīng)體系為20μL，包括DNA 模板(100 ng/μL)1μL，2×Taq PCR MasterMix (天跟生化)10μL，(10μmol/L)和16SB(10μmol/L)各0.5μL,dd H2O 8μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離后用EB染色并于凝膠成像儀上觀察，都能擴(kuò)增出明顯單一亮度很亮的條帶，符合預(yù)期中的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工用M13F和M13R雙向測(cè)序。

1.3　數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X(1.83)[18]對(duì)序列進(jìn)行對(duì)位排列，并結(jié)合人工校正。通過MEGA5.0軟件[19，20]分析序列的堿基組成、變異位點(diǎn)，同時(shí)采用Kimura雙參數(shù)法計(jì)算種間的遺傳距離。設(shè)置非洲真副鱧(Parachannainsignis，AP006042)為外群參考，分別采用NJ法(Neighbor-joining)和ML法(Maximum Likehood)對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Kimura 2-parameter模型、Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)1000次，最后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1　16S rRNA PCR 擴(kuò)增及序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別得到了4種鱧的16S rRNA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物，得到序列大小為573bp(烏鱧、斑鱧、月鱧)和572bp(線鱧)。在所測(cè)得的108個(gè)序列中，共檢測(cè)到10個(gè)單倍型，已提交NCBI(KT358469-K358478)。其中，烏鱧4個(gè)單倍型(CA-H1，CA-H2，CA-H3，CA-H4)；斑鱧2個(gè)單倍型(CM-H1，CM-H2)；月鱧2個(gè)單倍型(CAS-H1，CAS-H2)；線鱧2個(gè)單倍型(CS-H1，CS-H2)。4種鱧所有單倍型之間共存在1個(gè)插入/缺失，此外有63個(gè)變異位點(diǎn)(圖1)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)60個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比例為11.2%。總體上看，序列中轉(zhuǎn)換多于顛換，轉(zhuǎn)換(si=16)/顛換(sv=11)之比為1.4，說明序列突變未達(dá)到飽和，各單倍型之間變異位點(diǎn)如圖2所示。在所有單倍型中，堿基A(30.2%)占最多，其余T、C、G分別占21.2%、25.9%和22.7%，其中A+T含量(51.4%)高于C+G含量(48.6%)(表1)。

僅列出變異點(diǎn);H1~H4：?jiǎn)伪缎?CA:烏鱧；CM:斑鱧；CAS：月鱧；CS：線鱧圖1　4種鱧基于線粒體16S rRNA基因的比對(duì)

圖2　4種鱧基于16S部分基因序列的NJ樹

表1　4種鱧線粒體16S rRNA片段堿基組成及單倍型

基于Kimura雙參數(shù)法，以轉(zhuǎn)換+顛換、轉(zhuǎn)換/顛換計(jì)算單倍型間的相對(duì)遺傳距離(表2)。K2P模型下顯示，4種鱧屬魚類種間差異(0.021～0.079)明顯大于種內(nèi)差異(0.002～0.004)。種間最小遺傳距離位于烏鱧和斑鱧之間(0.021)，種間最大遺傳距離位于烏鱧與線鱧之間(0.079)、斑鱧與線鱧之間(0.079)。

表2　4種鱧基于部分16S基因序列在K2P模型下的遺傳距離

注：H1~H4、單倍型;CA、烏鱧；CM、斑鱧；CAS、月鱧；CS、線鱧

2.2　系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3　4種鱧基于16S部分基因序列的ML樹

以非洲真副鱧為外群，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建了NJ和ML進(jìn)化樹，結(jié)果分別見圖2和圖3。2種類型的系統(tǒng)進(jìn)化樹獲得一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，均支持烏鱧和斑鱧親緣關(guān)系最近，然后和月鱧聚為一支，線鱧位于進(jìn)化樹的基部，是4種鱧屬魚類最早分化出來的種，最后與非洲真副鱧聚在一起。

3討論

基于16S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，目前普遍應(yīng)用于魚類的分類鑒定。本研究在擴(kuò)增16S rRNA時(shí)，在合成引物時(shí)加了M13接頭，與常用于COI部分基因擴(kuò)增一樣[21,22]，測(cè)得的結(jié)果更準(zhǔn)確。從108個(gè)樣品中僅獲得10個(gè)單倍型，每個(gè)物種的單倍型序列差異度最高為0.004，這跟每個(gè)群體取得的樣本數(shù)量有關(guān)，同時(shí)證實(shí)了16S rRNA基因在這4種鱧中同樣比較保守。研究中發(fā)現(xiàn)，4種堿基所占的百分含量在4種鱧16S rRNA擴(kuò)增片段中相差不大；在所有單倍型中，堿基A(30.2%)占最多，A+T含量(51.4%)高于C+G含量(48.6%)，這與報(bào)道的其他鱸形目魚類16S rRNA基因的組成相似[23]。

NJ和ML構(gòu)建進(jìn)化樹的方法不一樣。NJ法運(yùn)算速度快，但該算法每迭代運(yùn)算一次只能夠搜索最近鄰居配對(duì)，對(duì)其他可能的配對(duì)不加以考慮，只能生成單一最優(yōu)樹，這樣可能遺漏一些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更合理的次優(yōu)樹；而ML法是考慮了所有可能的途徑，能完全利用數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)生信息[24]。在本研究中，不管采用NJ法還是ML法構(gòu)建進(jìn)化樹，都顯示4中鱧屬魚類中，首先聚在一起，烏鱧和斑鱧的親緣關(guān)系最近，這也說明烏鱧和斑鱧是4種中國(guó)鱧屬魚類最晚從一個(gè)物種分化出來的，表明烏鱧和斑鱧雜交的可交配性較高。Herbert等學(xué)者提出物種鑒定差異度臨界值為2%[25]，本研究中烏鱧和斑鱧的種間遺傳距離為0.021，微大于臨界值。從理論上講，有利于雜交鱧的形成。

本研究利用16S rRNA基因序列對(duì)4種鱧屬魚類進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，從分子進(jìn)化方面為4種鱧屬種間鑒定提供了基礎(chǔ)參考資料，也為種間雜交提供了依據(jù)。

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[引著格式]朱樹人，孟慶磊，孫玉旋,等.基于線粒體16S rRNA基因序列的鱧屬魚類系統(tǒng)進(jìn)化探討[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2015，12(27)：25～29.

[中圖分類號(hào)]Q812;Q959.48

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]16731409(2015)27002505

通信作者：

[作者簡(jiǎn)介]朱樹人(1986-)，男，博士，助理研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。朱永安,zhuyongan1965@163.com。

[基金項(xiàng)目]上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206);山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目；國(guó)家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-46-37)。

[收稿日期]2015-08-15