付 嬈，程 欣

(東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林吉林132012)

金納米粒子表面吸附蛋白在許多領(lǐng)域，特別是生物納米技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［1］。蛋白的純化是研究其功能和結(jié)構(gòu)或者其潛在應(yīng)用的先決條件。各種色譜分析方法由于其高的解析能力成為蛋白純化中占主導(dǎo)地位的方法［2］。在各種色譜技術(shù)中，蛋白的分離主要依靠它們的生物和物理化學(xué)性質(zhì)、分子尺寸、凈電荷、生物特異性和疏水性［3］。由Porath首次提出的IMAC法是目前最有效的蛋白吸附方法［4］。其原理是基于蛋白質(zhì)的組氨酸咪唑基、色氨酸的吲哚基和半胱氨酸的巰基能與銅、鋅、鎳離子之間形成穩(wěn)定的螯合物而進(jìn)行分離的。與傳統(tǒng)的生物親和配體相比，使用金屬離子更加經(jīng)濟、規(guī)模更小、性質(zhì)穩(wěn)定，吸附效率也因此而提高。但是這種分離操作的方法繁瑣、需時較長、效率低、操作過程中損失較大。因此，需要引入一個新的基質(zhì)使蛋白質(zhì)的分離和純化變得簡單和經(jīng)濟。血紅蛋白是血液的重要組成成分，可以與許多種類的內(nèi)源性和外源性配體結(jié)合，其組氨酸殘基含量豐富，是一種很好的Histag 模型蛋白［5］。

本文以谷胱甘肽為配體將Ni2+離子修飾到金納米粒子的表面，利用這種粒子可以將牛血紅蛋白從牛血紅蛋白和牛血清白蛋白的混合物中分離出來，這種粒子可以為純化血紅蛋白提供一種簡單、方便、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛血紅蛋白，牛血清白蛋白，谷胱甘肽，氯金酸，檸檬酸鈉，硫酸鎳，氯化鈉購于Sigma－Aldrich公司。丙烯酰胺(AR)，十二烷基磺酸鈉(AR)，過硫酸銨(AR)Tris(AR)，甘氨酸(AR)，N，N，N'，N'－四甲基(AR)，考馬斯亮藍(lán)(AR)，蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(AR)，甲醇(AR)，冰醋酸(AR)，購買于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

Cary－100紫外吸收光譜儀，Sigma3K－30型離心機，PB－20型pH計，DYY－6C型號電泳儀。所有實驗在室溫下進(jìn)行，溫度為25±2℃。

1.2 實驗過程

1.2.1 金納米粒子的表面修飾

用檸檬酸還原氯金酸的方法合成金納米粒子［6］。將離心提純后的金粒子調(diào)至pH9.0，然后將60 μmol/L的谷胱甘肽溶液加入到金溶膠中。離心提純后分別將金溶膠調(diào)至不同的pH值(3.0－9.0)，然后加入50 μmol/L的Ni2+離子。每種樣品測試至少重復(fù)5次。

1.2.2 Ni2+離子修飾的金粒子對蛋白的吸附和脫附過程

將10 μL，10 mg/mL的牛血紅蛋白(BHb)和牛血清白蛋白(BSA)水溶液分別加入到1 mL修飾后的金溶膠中，混合溶液在pH3.0－9.0的條件下室溫?fù)u床震蕩1 h。離心后分別吸取上清液測試上清中剩余的蛋白的濃度，吸附效率由公式ηad=(OD0－ODL)/OD0計算得到，其中吸光度OD0代表混合溶液中初始蛋白的濃度，ODL代表離心后上清液中蛋白的濃度。測量蛋白的脫附效率時，吸附蛋白后的粒子通過離心收集之后又重新分散在1 mol/L咪唑的水溶液中，室溫下?lián)u床振蕩1 h。離心后，測得此時上清液在406 nm處的吸光度為ODR。將金納米粒子對蛋白的吸附量與金粒子的質(zhì)量做比值，得到對蛋白的絕對吸附量(mg/mg)。

1.2.3 粒子對兩種蛋白混合物的選擇性吸附

在pH=7.0時，將10 μL，10 mg/mL的BHb和BSA溶液混合后，加入到1 mL表面修飾Ni2+離子的金納米粒子水溶液中，方法同上。將提取前的兩種蛋白混合液及上述溶液進(jìn)行紫外光譜測試及SDS電泳測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒子對牛血紅蛋白的高效吸附

通過改變提取蛋白時的pH值，用螯合了Ni2+離子的金納米粒子來研究粒子對兩種蛋白提取效率的變化規(guī)律，提取過程中保持金納米粒子的用量和溫度等條件不變。從圖1可以看出，BHb和BSA在pH3.0時吸附效率都達(dá)到最高值，而BHb在pH7.0處吸附量有一個較高值，此條件正處在BHb的等電點即pH7.5附近。在pH3.0時，處于金粒子的等電點附近。

與蛋白在等電點吸附量最大的原理相似，此時粒子對兩種蛋白的吸附量都達(dá)到了最大值。當(dāng)pH＜7.0時，粒子表面帶負(fù)電，而BHb帶正電，蛋白與粒子之間存在著靜電相互作用，兩種粒子都能夠吸附BHb。同時，Ni2+離子可以與BHb分子中的咪唑基配位，此時靜電作用和配位作用共同存在，使得吸附量明顯提高。當(dāng)pH＞7.0時，粒子表面帶負(fù)電而無法通過靜電作用吸附BHb，只能通過Ni2+離子與BHb分子中的咪唑基配位實現(xiàn)對蛋白的吸附。粒子對BHb的最大吸附量為1.66 mg/mg，遠(yuǎn)大于對BSA的最大吸附量0.91 mg/mg。為了進(jìn)一步考察粒子對BHb的吸附能力，在室溫下測試了pH3.0時粒子對BHb的吸附等溫線，如圖2所示，粒子對BHb的吸附量隨BHb濃度增加而增加。當(dāng)BHb的濃度為0.40 mg/ml時，粒子對BHb的負(fù)載量達(dá)到了飽和狀態(tài)。此后，即使增加BHb的濃度，粒子對BHb的吸附量也不改變。通過計算，Ni2+離子修飾的金納米粒子對BHb的最大吸附量為5.56 mg/mg。

圖1 螯合Ni2+離子的金粒子對BHb和BSA吸附量隨pH的變化

2.3 對兩種蛋白質(zhì)的選擇性吸附研究

由前面的研究可知，影響蛋白吸附的關(guān)鍵因素是溶液的pH值及蛋白本身的等電點。如果利用不同蛋白的等電點的差異，相應(yīng)地調(diào)整溶液的pH值，通過配位作用就會使不同等電點的蛋白產(chǎn)生不同的吸附效果，從而達(dá)到對蛋白的分離和提純的目的。以BHb和BSA為模型，研究從兩種蛋白中選擇性吸附一種蛋白。選擇在pH=7.0時，即BHb的等電點附近進(jìn)行提取實驗，將BHb和BSA的混合液吸附前的原溶液(A)、吸附后的上清液(B)和脫附后上清液即脫附液(C)分別進(jìn)行紫外光譜測試，得到結(jié)果如圖3所示。

圖2 pH3.0條件下螯合Ni2+的金粒子對BHb的吸附等溫線

圖3 pH7.0條件下BHb和BSA的混合液吸附前的原溶液(A)、吸附后的上清液(B)和脫附后上清液(C)的紫外光譜

由圖3可知，吸附后，BHb在406 nm處的吸收峰值有明顯下降，而咪唑洗脫后的洗脫液在406 nm處也有吸收峰出現(xiàn)，說明粒子能夠?qū)Hb吸附下來。但是對于BSA來說，其在280 nm處的吸收峰與BHb重合。洗脫后，此處的吸收峰又被咪唑的吸收峰覆蓋，因此無法由紫外光譜判斷此時在洗脫液里是否也存在BSA。因此，將A、B、C三種溶液進(jìn)行蛋白電泳測試。電泳結(jié)果顯示，在該條件下粒子對BSA沒有吸附，從兩種蛋白混合物中只提取出了BHb。利用配位作用提取蛋白的原理已經(jīng)被廣泛研究，蛋白質(zhì)(His－tag蛋白)中所包含的組氨酸殘基中咪唑基團(tuán)的氮原子，可以與金屬離子進(jìn)行配位作用，從而吸附到粒子表面。而這種配位作用可能受到組氨酸殘基的數(shù)量以及其親和性的影響［7］。BHb中含有24個組氨酸殘基，而BSA中只含有2個組氨酸殘基，因此粒子對BHb的吸附量要遠(yuǎn)大于BSA。在pH 7.0的條件下，Au－GSH－Ni2+納米粒子表面帶負(fù)電，而BSA(pI=4.8)表面帶負(fù)電，因此BSA不可能直接通過靜電作用吸附到粒子表面。對于BHb(pI=7.5)來說，此時處于其等電點附近，而且BHb帶少量正電，因此吸附量達(dá)到較高值。因此，在該實驗條件下，粒子對BHb的吸附能力要遠(yuǎn)高于BSA。粒子對BHb的吸附量為1.08 mg/mg，脫附量為0.2 mg/mg。以上結(jié)果充分證明，Ni2+離子修飾的金納米粒子可以實現(xiàn)在BHb和BSA的混合物中對BHb的高選擇性吸附。

3 結(jié) 論

本文在谷胱甘肽修飾的金納米粒子表面螯合了Ni2+離子后，研究了牛血紅蛋白(BHb)在其表面的吸附行為。粒子對牛血紅蛋白的最大吸附量可達(dá)到5.56 mg/mg。利用該粒子可以將牛血紅蛋白(BHb)從牛血紅蛋白(BHb)和牛血清白蛋白(BSA)的混合物中分離出來。該粒子為血紅蛋白的提取和純化提供了一個新的方法，具有很好的實際應(yīng)用前景。

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