林新恭，吳文藝，張麗婷，黃種心，王朝陽(yáng)

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科，福建 泉州 362000；2.解放軍第一八零醫(yī)院內(nèi)二科，福建 泉州 362000）

HIC1和SIRT1的異常表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系研究

林新恭1，吳文藝1，張麗婷2，黃種心1，王朝陽(yáng)1

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科，福建 泉州 362000；2.解放軍第一八零醫(yī)院內(nèi)二科，福建 泉州 362000）

目的探討腫瘤高甲基化基因1（HIC1）和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）的異常表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法利用免疫組化方法檢測(cè)80例甲狀腺乳頭狀癌組織及相應(yīng)的80例癌旁正常組織中HIC1和SIRT1的表達(dá)水平。并根據(jù)免疫組化結(jié)果，分析甲狀腺癌組織中HIC1及SIRT1的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 HIC1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常甲狀腺組織（P＜0.01）；SIRT1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常甲狀腺組織（P＜0.01）；HIC1與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、年齡及TNM分期相關(guān)（P＜0.05）；甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1表達(dá)與SIRT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.759，P＜0.01）。結(jié)論HIC1和SIRT1的異常表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，HIC1有望成為甲狀腺乳頭狀癌預(yù)防和治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

高甲基化基因1；沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1；甲狀腺乳頭狀癌

腫瘤高甲基化基因1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）是最近發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，該基因位于17號(hào)染色體P53基因遠(yuǎn)端17p13.3位點(diǎn)。HIC1在正常組織中廣泛表達(dá)，但在多種腫瘤中表達(dá)缺失［1］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent mating type information regulation 1，SIRT1）是HICl下游的重要信號(hào)靶點(diǎn)之一，是煙酰胺（NAD+）依賴的蛋白去乙?；?，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著作用［2］。而HIC1及SIRT1在甲狀腺癌中的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究采用免疫組化方法，檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1和SIRT1的表達(dá)情況，并分析HIC1與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探討其在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

所有新鮮組織標(biāo)本均于2013年3月至2014年3月取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科（均取得患者知情同意），其中甲狀腺乳頭狀癌組織80例，癌旁正常甲狀腺組織80例（對(duì)側(cè)甲狀腺正常組織，均經(jīng)病理證實(shí)）作為對(duì)照組。甲狀腺乳頭狀癌組中男28例，女52例；年齡26～62歲，中位年齡45歲；其中伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟和美國(guó)抗癌協(xié)會(huì)2002年的甲狀腺癌臨床分期，Ⅰ期36例，Ⅱ期20例，Ⅲ期18例，ⅣA期6例。所有癌組織經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)均為甲狀腺乳頭狀癌，術(shù)前甲狀腺功能均正常，均未接受放、化療，均有完整的臨床和病理資料。手術(shù)獲取組織標(biāo)本后，平均分為2份，用4%多聚甲醛液固定，于我院病理科常規(guī)脫水石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，行HE染色，由我院病理科行病理診斷證實(shí)。鼠抗人HIC1和SIRT1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，0.1 mol/L PBS、生物素標(biāo)記二抗、0.01 mol/L枸鹽酸鹽緩沖液購(gòu)自武漢博士德公司，二甲苯、乙醇、雙氧水、丙酮等均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

免疫組化定性檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常甲狀腺中HIC1、SIRT1的表達(dá)。每例石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片2張，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.1 甲狀腺組織免疫組化染色的操作步驟：（1）玻片防脫片處理：2%APES（丙酮1∶50稀釋）浸泡30～50 min，自然晾干；（2）組織貼片后置恒溫箱（60℃）60 min，使切片緊密黏附；（3）脫蠟復(fù)水：石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫蠟各10 min，然后放入100%、100%、95%、95%、80%、80%各級(jí)乙醇溶液中5 min，再放入蒸餾水中3 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min；（4）3%H2O2，37℃孵育60 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，0.1 mol/L PBS沖洗5 min×3次；（5）抗原高壓修復(fù)：將切片完全浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，并將此容器至于高壓鍋中。加熱，當(dāng)壓力鍋開(kāi)始慢慢噴氣時(shí)，關(guān)閉高壓閥。噴氣后計(jì)時(shí)3～5 min，關(guān)閉電源，自然冷卻降壓后連同緩沖液一起取出切片。室溫下自然冷卻，0.1 mol/L PBS沖洗5 min×3次；（6）10%正常山羊血清抗原封閉，37℃孵育60 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min×3次；（7）滴加鼠抗人HIC1/SIRT1的一抗（最終稀釋濃度為1∶100，2 μg/mL），4℃過(guò)夜，0.1 mol/L PBS沖洗5 min×3次；（8）滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育30 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min× 3次；（9）滴加親和素標(biāo)記辣根酶過(guò)氧化物酶工作液，37℃或室溫孵育20 min，0.1 mol/L PBS沖洗5 min×4次；（10）DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；（11）0.1 mol/L PBS沖洗5 min×3次；（12）蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10～15 min；（13）石蠟切片經(jīng)75%，95%，100%梯度乙醇中3～5 min進(jìn)行脫水，然后放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5～10 min透明；（14）中性樹(shù)脂封片、鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定：HIC1陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，以細(xì)胞核表達(dá)為主，黃色至棕褐色顆粒；SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核中，黃色或棕色顆粒。每例隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×400），確定每個(gè)視野的陽(yáng)性率。HIC1染色強(qiáng)度：基本不著色為0分；淺黃為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比率判定：細(xì)胞染色＜10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，＞50%為3分，兩者得分相乘，＜1分判定為表達(dá)陰性，其他的判定為表達(dá)陽(yáng)性。SIRT1染色強(qiáng)度：基本不著色為0分，淺黃為1分，深黃或者棕黃為3分，介于淺深黃之間為2分；陽(yáng)性細(xì)胞比率判定：無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性染色為0分，陽(yáng)性染色1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分，兩者得分相乘，＜1分的判定為表達(dá)陰性，其他的判定為表達(dá)陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)40組中每組甲狀腺癌中HIC1及SIRT1相對(duì)的評(píng)分水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)，并通過(guò)單因素ANOVA分析比較均值。利用統(tǒng)計(jì)Spearman相關(guān)分析計(jì)算癌組織中HIC1及SIRT1表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIC1蛋白的表達(dá)情況

HIC1免疫組化染色顯示正常甲狀腺組織中HIC1在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)（陽(yáng)性率87%），以細(xì)胞核表達(dá)為主；甲狀腺乳頭狀癌中HIC1僅在部分細(xì)胞核內(nèi)低表達(dá)（陽(yáng)性率40%），且表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常甲狀腺組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1A、1B。

2.2 HIC1蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系

在甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIC1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)要低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高年齡組（≥45歲）表達(dá)水平顯著低于低年齡組（＜45歲），且甲狀腺癌的TNM分期愈高（Ⅲ～Ⅳ期），HIC1表達(dá)水平愈低。HIC1蛋白的表達(dá)與患者的性別、腫瘤大小及包膜侵犯均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 各組織中HIC1和SIRT1表達(dá) HE×400Fig.1 Expression of HIC1 and SIRT1 in different tissues HE×400

2.3 SIRT1蛋白的表達(dá)情況

SIRT1免疫組化染色顯示正常甲狀腺組織中SIRT1僅在部分細(xì)胞核內(nèi)低表達(dá)（陽(yáng)性率31%）；甲狀腺乳頭狀癌中SIRT1主要定位于細(xì)胞核中，黃色或棕色顆粒（陽(yáng)性率83%），表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常甲狀腺組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1C、1D。免疫組化甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1表達(dá)與SIRT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.759 P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌中SIRT1與HIC1之間的相關(guān)分析Fig.2 Correlation analysis of SIRT1 and HICI1 in cancer tissues

表1 HIC1表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of HIC1 and clinical pathological features of papillary thyroid carcinoma

3 討論

腫瘤HIC1基因定位于染色體部17p13.3位點(diǎn)、腫瘤抑制基因p53遠(yuǎn)端。這個(gè)基因可以編碼1個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，該轉(zhuǎn)錄抑制因子識(shí)別的靶基因與細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成及侵犯等作用有關(guān)，并且廣泛存在于正常組織中。在許多原發(fā)腫瘤中HIC1基因表達(dá)沉默，如小兒髓母細(xì)胞瘤［3，4］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和室管膜瘤［5］等。Sonnet等［6］發(fā)現(xiàn)HIC1在小兒急性髓性白血病中低表達(dá)，并且可能與HCI1基因啟動(dòng)子甲基化異常有關(guān)。Pan等［7］發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中HIC1的表達(dá)可能受到dsRNA的干擾，而呈現(xiàn)一種抑制狀態(tài)，對(duì)腫瘤的發(fā)生起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1表達(dá)明顯低于正常甲狀腺組織（P＜0.01）。因此我們推測(cè)HIC1低表達(dá)可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生密切相關(guān)。

SIRT1屬于m型組蛋白去乙?；福诩?xì)胞損傷修復(fù)、抵抗應(yīng)激、延長(zhǎng)壽命、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮作用［8～10］。在SIRT1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)和調(diào)整以增加其存活機(jī)會(huì)，延長(zhǎng)其生存時(shí)間的同時(shí)，也有可能使腫瘤細(xì)胞獲得異常的增殖生長(zhǎng)能力，抑制其發(fā)生凋亡［11］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在許多惡性腫瘤（如胃癌［12，13］、賁門癌［14］、結(jié)腸癌［15］、乳腺癌［16］、鱗癌［17］等）SIRT1的表達(dá)量增加。HIC1可以參與SIRT1調(diào)控。HIC1可以和SIRT1結(jié)合，結(jié)合后形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。該復(fù)合物和SIRT1啟動(dòng)子結(jié)合后抑制其轉(zhuǎn)錄。HIC1蛋白失活可以導(dǎo)致SIRT1表達(dá)上調(diào)。本研究中甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)比癌旁正常甲狀腺組織表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。相關(guān)分析表明甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1蛋白表達(dá)與SIRT1的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。因此，我們推斷甲狀腺乳頭狀癌組織中HIC1的低表達(dá)和SIRT1過(guò)度表達(dá)有關(guān)，HIC1表達(dá)沉默導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌組織中SIRT1表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)HICl/SIRTl信號(hào)通路參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生。

影響甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的因素有性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)癌是否侵出包膜及有無(wú)周圍器官侵犯［18］。本研究結(jié)果表明甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIC1蛋白表達(dá)水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，高年齡組（≥45歲）表達(dá)水平顯著低于低年齡組（＜45歲），且甲狀腺癌的分期愈高，HIC1表達(dá)水平愈低，表明甲狀腺乳頭狀癌HIC1的表達(dá)水平與其預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，HICl及SIRTl腫瘤因子可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展。它們?cè)诩谞钕偃轭^狀癌的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，為甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)防和基因治療提供新的作用靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Jenal M，Britschgi C，F(xiàn)ey MF，et al.Inactivation of the hypermethylated in cancer 1 tumour suppressor-not just a question of promoter hypermethylation?［J］.Swiss Med Wkly，2010，140：w13106.

［2］Saunders LR，Verdin E.Sirtuins：critical regulators at the crossroads between cancer and aging［J］.Oncogene，2007，26（37）：5489-5504.

［3］Huffman DM，Grizzle WE，Bamman MM，et al.SIRT1 is significantly elevated in mouse and human prostate cancer［J］.Cancer Res，2007，67（14）：6612-6618.

［4］Stocklein H，Smardova J，Macak J，et al.Detailed mapping of chromosome 17p deletions reveals HIC1 as a novel tumor suppressor gene candidate telomeric to TP53 in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Oncogene，2008，27（18）：2613-2625.

［5］Tseng RC，Lee CC，Hsu HS，et al.Distinct HIC1-SIRT1-P53 loop deregulation in lung squamous carcinoma and adenocarcinoma patients［J］.Neoplasia，2009，11（8）：763-777.

［6］Sonnet M，Claus R，Becker N，et al.Early aberrant DNA methylation events in a mouse model of acute myeloid leukemia［J］.Genome Med，2014，6（4）：34.

［7］Pan S，Wang Z，Chen Y，et al.Inactivation of tumor suppressor gene HIC1 in gastric cancer is reversed via small activating RNAs［J］. Gene，2013，527（1）：102-108.

［8］王麗輝，金煒元，陳勇，等.Sir2基因家族的功能和作用機(jī)制［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2006，28（6）：822-826.

［9］Kim EJ，Um SJ.SIRT1：roles in aging and cancer［J］.BMB Reports，2008，41（11）：751-756.

［10］Cohen HY，Miller C，Bitterman ICD，et a1.Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase［J］.Science，2004，305（5682）：390-392.

［11］Ogura K，Hirata Y，Yanai A，et al.The effect of helicobacter pylori eradication on reducing the incidence of gastric cancer［J］.Clin Gastroenterol，2008，42（3）：279-283.

［12］Cha FJ，Noh SJ，Kwon KS，et al.Expression of DBC1 and SIRT1 is associated with poor prognosis of gastric carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（13）：4453-4459.

［13］趙偉，陳銳，劉芮菡，等.沉默信息調(diào)節(jié)因子1對(duì)胃癌侵襲的影響及其機(jī)理研究［J］.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2014，21（4）：425-431.

［14］馮安寧，樊祥山，黃勤，等.SIRT1在賁門癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究［J］.河北醫(yī)藥，2010，32（9）：104-106.

［15］Stünkel W，Peh BK，Tan YC，et al.Function of the SIRT1 protein deacetylase in cancer［J］.Biotechnol J，2007，2（11）：1360-1368.

［16］Lee H，Kim KR，Noh SJ，et al.Expression of DBC1 and SIRT1 is associated with poor prognosis for breast carcinoma［J］.Hum Pathol，2011，42（2）：204-213.

［17］Hida Y，Kubo Y，Murao K，et al.Strong expression of a longevity related protein，SIRT1，in Bowen's disease［J］.Arch Dermatol Res，2007，299（2）：103-106.

［18］董志偉，谷銑之.臨床腫瘤學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：618-619.

（編輯 武玉欣）

Aberrant Expressions of HIC1 and SIRT1 Contribute to the Development of Papillary Thyroid Carcinoma

LINXin-gong1，WUWen-yi1，ZHANGLi-ting2，HUANG Zhong-xin1，WANGChao-yang1

（1.Department of General Surgery，The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China；2.Department of Endocrinology，180th Military Hospital of Chinese People’s Liberation Army，Quanzhou 362000，China）

Objective To investigate the expression of HIC1and SIRT1 in papillary thyroid carcinoma and adjacent normal thyroid tissue，so as to explore its biological significance.MethodsImmunohistochemical staining were used to analyze the expression differences of HIC1 and SIRT1 in tissues of papillary thyroid carcinoma（80 cases）and adjacent normal thyroid（80 cases），and the data was statistically analyzed.ResultsCompared with adjacent normal thyroid tissue，the expression of HIC1 in papillary thyroid carcinoma was significantly lower（P＜0.01），while the expression of SIRT1 in papillary thyroid carcinoma was significantly higher（P＜0.01）.The expression of HIC1 was lowerin the group with lymph node metastasis than in the group without lymph node metastasis（P＜0.05）.Further clinical analysis demonstrated significant association of the expression of HIC1 with both age of patients and stage of disease（P＜0.05）.The expression of HIC1 and SIRT1 also showed a strong inverse correlation（r=-0.759，P＜0.01）.ConclusionAberrant expression of HIC1 and SIRT1 in papillary thyroid carcinoma mightplay an importantrole in the oncogenesis and progress of papillary thyroid carcinoma.HIC1 is expected to become a novel marker for prevention and treatment of papillary thyroid carcinoma.

hypermethylated in cancer 1；silent mating type information regulation 1；papillary thyroid carcinoma

R736.1

A

0258-4646（2015）11-0995-04

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題（2013ZD29）；福建省自然科學(xué)基金（2014J01409）；福建省泉州市科技計(jì)劃（2013Z87）

林新恭（1985-），男，醫(yī)師，碩士.

吳文藝，E-mail：wwyii8522858@1163.com

2015-04-19

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